مقالات

تمرین، ویسفاتین، بیان، ویسفاتین، این

دانلود پایان نامه

A احتمالی و 1 میکرولیتر بافر 10X تا رسیدن به حجم نهایی10 میکرولیتر اضافه شد. سپس انکوبه‌کردن تیوب‌ها در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۳۰ دقیقه و اضافه‌کردن یک میکرولیتر EDTA و انکوبه‌کردن آن در دمای ۶۵ درجه به مدت ۱۰ دقیقه انجام گرفت. بعد، افزودن یک میکرولیتر هگزامر تصادفی79 به میکروتیوب‌ها و انکوباسیون آن در دمای۷۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ دقیقه صورت گرفت. این مرحله باعث دناتوره‌شدن RNA و از بین رفتن ساختارهای ثانویه آن می‌گردد. بلافاصله پس از انتقال تیوب‌ها به روی یخ، مواد RNasin 5/0 میکرولیتر، مخلوط10 میلی‌مول dNTP و 20 واحد آب عاری از RNase به ترتیب اضافه گردید. در مرحله بعدی، انکوباسیون مخلوط واکنش به مدت ۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد در دستگاه ترمال سایکلر انجام شد. سپس، اضافه‌کردن یک میکرولیتر آنزیم RT، انکوباسیون مخلوط واکنش به مدت ۶۰ دقیقه در دمای ۴۲ درجه سانتی‌گراد در دستگاه ترمال سایکلر انجام گرفت. حرارت‌دادن در دمای ۷۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۰ دقیقه در دستگاه ترمال سایکلر، جهت غیرفعالسازی آنزیم RT و دناتوره‌شدن کمپلکس RNA-cDNA صورت گرفت.
3-11-1-2- مراحل انجام PCR
تکثیر قطعات ژن‌های ویسفاتین و بتا اکتین توسط روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)80 با جفت پرایمرهای طراحی‌شده انجام گرفت (جدول 3-1). محلول واکنش PCR با حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل 100 نانوگرم DNA ژنومی، Pmol40 از هر یک از پرایمرها، 5/1 میلی‌مولMgCl2 ، 2/0 میلی‌مول dNTP و 25/0 واحد از آنزیم Taq پلیمراز تهیه شد. تکثیر قطعه مورد نظر در دستگاه ترموسایکلر (شرکت کوربت81، کشور استرالیا( طبق برنامه ذیل انجام گرفت. برای تشخیص محصولات PCR، قطعات تکثیریافته به روش الکتروفورز در ژل آگارز 2% قابل تفکیک بودند. پس از الکتروفورز، ژل آگارز به مدت 10 دقیقه در µgr/dl1 از محلول اتیدیوم بروماید قرار گرفت و قطعات DNA با دستگاه ژل‌خوان (شرکت اپتیکو82، کشور هلند( بررسی شدند.
جدول 3-1. مراحل انجام PCR
درجه حرارت (سانتی‌گراد)
تعداد چرخه
واسرشتگی
10 دقیقه
یک
45 ثانیه
جفت‌شدن
یک دقیقه
طویل‌شدن
طویل‌شدن نهایی
5 دقیقه
بتا اکتین یک ژن همیشه بیان‌شونده است و میتواند شاهد خوبی برای بررسی کل فرایند تخلیص mRNA باشد. بیان ژن ویسفاتین، از طریق تخلیصmRNA بافت با استفاده از روش گوانیدنیم تیوسیانات83، جداسازی mRNA با استفاده از کیت84 طبق دستورالعمل داده شده و سپس سنتز cDNA از آن و در نهایت تعیین سطوح نسبی بیان ژن با استفاده از روش نیمه‌کمی RT-PCR انجام گردید. از هر یک از موش‌ها، یک میکروگرمmRNA برای ساخت اولین رشته cDNA به کار رفت. در این مطالعه برای ساخت cDNA از پرایمر الیگو dT در دمای 42 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت استفاده شد و کیت مزبور از شرکت فرمنتاز85 آلمان خریداری شده بود. سطح نسبی mRNAژن ویسفاتین با روش RT-PCRنیمه‌کمی اندازه‌گیری شد. پرایمرهای ویژه ویسفاتین عبارت‌اند از:
For-vis 5`-ACCAACTGGATTGAGACTATTC-3`
Length: 22
Rev-vis P: 5`-GACTCCTCTGTAGCCGAAG-3`
Length: 19
پرایمرهای ویژه بتا اکتین برای تکثیر این ژن به عنوان کنترل به کار رفت. این پرایمرها عبارت‌اند از:
Forward-beta-act: 5`- TTGTAACCAACTGGGACCCCCGATATG-3` (27 bp)
Reverse-beta-act: 5`- CGCTCTTGCCGATAGTGATG-3` (20 bp)
مقدار پلاسمایی ویسفاتین از طریق روش ELISA با استفاده از کیت Cusabio Biothech ساخت کشور چین اندازهگیری شد.
3-11-2- نحوه آماده‌سازی بافت‌ها
100 میلی‌گرم بافت در یک میلی‌لیتر بافر فسفات سالین (PBS 0.1M) توسط دستگاه هموژنایزر(Potter Elvejheim) به مدت 6 ثانیه با 8000 دور در دقیقه سردشده با یخ، هموژن شد. سپس به مدت 10 دقیقه با 3000 دور در دقیقه و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ گردید. پس از آن مایع رویی جدا گشته و جهت اندازه‌گیری ویسفاتین مورد استفاده قرار گرفت.
3-11-3- روش‌های تعیین غلظت متغیرهای تحقیق
غلظت ویسفاتین با استفاده از کیت مخصوص اندازه‌گیری ویسفاتین به روش الایزا و بر اساس دستورالعمل کارخانه سازنده کیت (USCN LIFE Science Inc، ساخت کشور چین، ضریب تغییرات برون‌آزمون86 1/7 درصد، حساسیت روش اندازه‌گیری87 ng/ml 08/0) تعیین گردید.
غلظت گلیکوژن نیز با استفاده از کیت Glycogen Colorimetric ساخت کشور چین با ضریب تغییرات 5/4 و حساسیت mg/ml09/0 اندازه‌گیری شد.
غلظت گلوکز پلاسما با روش آنزیمی ـ رنگ‌سنجی با فنآوری گلوکزاکسیداز و با استفاده از کیت گلوکز (شرکت پارس آزمون، ایران) اندازهگیری شد. ضریب تغییرات و حساسیت روش اندازهگیری به ترتیب 8/1 درصد و 5 میلیگرم بر دسیلیتر بود. غلظت گلیکوژن کبد با استفاده از کیت رنگ‌سنجی گلیکوژن (ساخت شرکت نانجینگ چین) با ضریب تغییرات 5/4 درصد و حساسیت 09/0 میلیگرم بر میلیلیتر اندازهگیری شد.
جهت سنجش غلظت پلاسمایی HDL-C و کلسترول از روش آنزیمی ـ فتومتریک (شرکت پارس آزمون، ایران) و تریگلیسیرید از روش آنزیمی ـ رنگ‌سنجی (شرکت پارس آزمون، ایران) استفاده شد. غلظت اسیدهای چرب آزاد نیز از روش آنزیمی ـ رنگ سنجی (Wako chemicals GmbH) اندازهگیری شد. برای تعیین غلظت LDL-C از روش محاسباتی فریدوالد و همکاران88 استفاده شد. ضریب تغییرات برون‌آزمونی و حساسیت روش اندازهگیری به ترتیب برای HDL-C، 2/2 درصد و یک میلیگرم بر دسیلیتر؛ کلسترول، 2/1 درصد و 3 میلیگرم بر دسیلیتر؛ تری‌گلیسیرید، 4/2 درصد و یک میلیگرم بر دسیلیتر و NEFA، 1/3 درصد و 1/0 میلیگرم بر دسیلیتر بود.
3-12- روش تجزیه و تحلیل آماری دادهها
برای دسته‌بندی و تعیین شاخصهای پراکندگی از آمار توصیفی (با استفاده از نرم افزار 19 (spss و از برنامه اکسل89 نیز برای رسم نمودار استفاده شد. و با توجه به اینکه آزمون کلموگروف- اسمیرنف نشان داد، که داده‌ها از توزیع طبیعی برخوردارند، لذا از آمار پارامتریک برای آزمون آماری فرضیه‌ها استفاده شده است. همچنین برای مقایسه میانگین بین دو گروه کنترل و تمرین از آزمون t مستقل90 استفاده گردید. در این بررسی‌ها مقدار معنی‌داری در سطح 05/0 P تعیین شد و مقدار P برابر و یا کمتر از 05/0 به معنای رد فرض صفر قلمداد گشت.
فصل چهارم ـ تجزیه و تحلیل یافته‌های پژوهش
در این فصل ابتدا با استفاده از آمار توصیفی، نتایج توصیفی متغیرهای وابسته پژوهش در قالب جدول و نمودار ارائه شده است و سپس تأثیر متغیر مستقل بر متغیرهای وابسته در هر یک از گروههای پ‍ژوهش شامل گروههای تمرینی و گروه کنترل مورد بررسی قرار میگیرد. علاوه بر این هر یک از فرضیههای ارائه شده در فصل اول با استفاده از آزمونهای آماری مناسب مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته است.
4-2- تجزیه و تحلیل توصیفی دادهها
4-2-1- بیان ژن ویسفاتین بافت چرب در گروه‌های مختلف
جدول 4-1، بیان ژن ویسفاتین را در گروه‌های مختلف نشان می‌دهد. با توجه به جدول 4-1، بیان ویسفاتین در بافت چرب احشایی در گروه‌های تمرین نسبت به گروه کنترل افزایش داشته است.
جدول 4-1 – بیان ژن ویسفاتین نسبت به بتااکتین در گروه‌های مختلف
متغیر
گروه بلافاصله
گروه 4 ساعت
گروه 24 ساعت
ویسفاتین بافت چرب/ بتا اکتین ( درصد)
02/9 ± 55/28
29/14± 78/29
20/18 ± 24/53
15/15 ± 97/48
شکل 4-1- تصویر ژل الکتروفورز ژن بتا اکتین و ویسفاتین در موشهای کنترل، M مارکر میباشد.
شکل 4-2- تصویر ژل الکتروفورز ژن بتا اکتین و ویسفاتین گروه بلافصله پس از تمرین، M مارکر میباشد.
شکل 4-3- تصویر ژل الکتروفورز ژن بتا اکتین و ویسفاتین گروه 4 ساعت بعد از تمرین، M مارکر میباشد.
شکل 4-4- تصویر ژل الکتروفورز ژن بتا اکتین و ویسفاتین گروه 24 ساعت بعد از تمرین، M مارکر میباشد.
چنانچه از شکلهای فوق مشخص است، ‌ژن بتااکتین که به عنوان کنترل تکثیر ژن ویسفاتین بکار رفته، در تمام نمونهها بیان شده است. بیان ژن ویسفاتین در بافتهای تمام موشهای گروه کنترل و تجربی به وضوح دیده میشود.
4-2-2- توصیف سایر متغیرهای پژوهش
در این بخش، اطلاعات توصیفی (میانگین و انحراف استاندارد) به‌دست آمده از متغیرهای مورد مطالعه در هر 4 گروه تحقیق در قالب جدول ارائه شده است. در جدول 4-2 غلظت پلاسمایی ویسفاتین و دیگر متغیرها ارایه شده‌اند که به شرح زیر می‌باشد:
غلظت ویسفاتین بافت چرب در گروه‌های تمرینی بلافاصله و 4 ساعت پس از تمرین افزایش داشته که در گروه تمرینی 24 ساعت پس از تمرین کاهش یافته است.
سطوح پلاسمایی ویسفاتین در تمام گروه‌های تمرینی نسبت به گروه کنترل افزایش داشته است.
سطوح گلوکز پلاسما در گروه‌های تمرینی نسبت به گروه کنترل کاهش داشته است که این کاهش‌ها معنی‌دار نبودند.
سطوح HDL پلاسمایی در گروه بلافاصله پس از تمرین افزایش معنی‌داری را نشان داده است اما در گروه‌های 4 ساعت و 24 ساعت پس از تمرین پس از تمرین کاهش غیر معنی‌داری داشته است.
سطوح LDL پلاسمایی در تمام گروه‌های تمرینی نسبت به گروه کنترل افزایش غیر معنی‌داری را نشان داده‌اند.
سطوح کلسترول تام (TC) در گروه تمرین بلافاصله نسبت به گروه کنترل افزایش غیرمعنی‌دار داشته اما در گروه‌های 4 و 24 ساعت پس از تمرین کاهش غیرمعنی‌دار را نشان داده است.
سطوح تری‌گلیسیرید پلاسمایی در تمامی گروه‌های تمرینی نسبت به گروه کنترل کاهش غیرمعنی‌داری را نشان داده است.
سطوح اسیدهای چرب استریفه‌نشده در گروه های بلافاصله و 24 ساعت پس از تمرین نسبت به گروه کنترل بالاتر بوده که در گروه بلافاصله، این افزایش معنی‌دار بوده است، اما در گروه 4 ساعت پس از تمرین، سطوح اسیدهای چرب استریفه‌نشده، کاهش غیرمعنی‌داری داشته است.
میزان گلیکوژن در گروه‌های بلافاصله و 4 ساعت پس از تمرین کاهش داشته که این میزان در گروه 4 ساعت معنی‌دار نبوده است و در گروه 24 ساعت پس از تمرین، این مقدار افزایش غیرمعنی دار را نشان داده است.
جدول 4-2- تغییرات پارامترهای اندازه‌گیری شده گروه‌های تحقیق (انحراف استاندارد ± میانگین)
گروه
متغیر
بلافاصله پس از تمرین
4 ساعت پس از تمرین
24 ساعت پس از تمرین
غلظت ویسفاتین بافت چرب
(نانو گرم/ گرم)
85/50 ± 78/1077
60/118± 65/1201 *
24/81± 30/1308 *
15/167± 46/1070
ویسفاتین پلاسما
(نانو گرم/ میلی‌لیتر)
74/23 ± 56/37
82/4 ± 60/12 *
89/10 ± 38/15 *
55/14 ± 18/17 *
گلوکز (میلیگرم بر دسیلیتر)
5/24 ± 0/412
5/37 ± 8/340
4/68 ± 4/360
9/76 ± 0/382
HDL (میلیگرم بر دسیلیتر)
6/5 ± 1/29
1/6 ± 2/38 *
2/3 ± 0/28
5/4 ± 3/27
LDL (میلیگرم بر دسیلیتر)
5/3 ± 5/78
6/23 ± 4/80
3/9 ± 8/82
2/16 ± 3/80
TC (میلیگرم بر دسیلیتر)
0/9 ± 8/130
9/18 ± 6/135
6/15 ± 4/130
7/12 ± 8/128
TG (میلیگرم بر دسیلیتر)
9/44 ± 8/115
9/11 ± 2/85
6/41 ± 8/97
3/40 ± 8/105
NEFA (میلیگرم بر دسیلیتر)
25/1 ± 57/4
98/0 ± 64/6 *
58/0 ± 41/4
54/0 ± 96/4
گلیکوژن کبد (میلیگرم بر گرم)
069/0 ± 30/0
033/0 ± 24/0 *
014/0 ± 27/0
025/0 ± 31/0
* (05/0 P≤)
4-3- تجزیه و تحلیل استنباطی یافتههای پژوهش
در این قسمت فرضیه‌های تحقیق مورد آزمون قرار میگیرد. تمام فرضیههای تحقیق در سطح معنی‌داری (05/0P≤) ارزیابی شده‌اند. برای آزمون توزیع طبیعی داده‌های از آزمون کولموگراف اسمیرنف و برای آزمون فرضیهها از آزمون تی مستقل استفاده شده و نتایج در جداول مربوطه ارائه گردیده است.
4-3-1- آزمون فرضیههای پژوهش
4-3-1-1- فرضیه اول
بین بیان ژن ویسفاتین بافت چرب احشایی گروه کنترل و گروه بلافاصله پس از تمرین، بعد از یک جلسه تمرین هوازی حاد تفاوت معنی‌داری وجود ندارد.
با توجه به تصویر ژل الکتروفورز و جدول زیر کاملاً مشخص است که بیان ژن ویسفاتین بافت چرب در موش‌های گروه بلافاصله تفاوت معنی‌داری با موش‌های گروه کنترل ندارد. بررسی نیمه‌کمی باندها با استفاده از نرم‌افزار UVITEC انجام و نسبت بیان ژن ویسفاتین به بیان ژن بتا اکتین محاسبه گردید.
نمودار 4-1- درصد بیان ژن ویسفاتین بافت چرب نسبت به بتا اکتین در هر یک از نمونههای کنترل و کشتار بلافاصله پس از تمرین
جدول 4-3- نتایج آزمون تی مستقل در گروه‌های کنترل و بالافاصله پس از تمرین
آزمون لون
درصد بیان ژن ویسفاتین بافت چرب نسبت به بتا اکتین
با فرض برابری واریانس
163/0 –
با فرض عدم برابری واریانس
752/6
با استفاده از آزمون تی مستقل مشخص شد که اختلاف معنی‌داری در بیان ژن ویسفاتین گروه‌های بلافاصله پس از تمرین و گروه کنترل وجود ندارد (875/0=p، 444/0=F، 163/0 – = t) (جدول 4-3).
نمودار 4-2- درصد بیان ژن ویسفاتین نسبت به بتااکتین گروه بلافاصله در مقایسه با گروه کنترل
چنانچه از جدول بالا مشخص است فرض صفر، پذیرفته میشود. به عبارت دیگر اختلاف معنی‌داری در بیان ژن ویسفاتین گروه‌ بلافاصله پس از تمرین و گروه کنترل وجود ندارد.
4-3-1-2- فرضیه دوم
بین بیان ژن ویسفاتین بافت چرب احشایی گروه کنترل و گروه 4 ساعت پس از تمرین، بعد از یک جلسه تمرین هوازی حاد تفاوت معنی‌داری وجود ندارد.
با توجه به تصویر ژل الکتروفورز و جدول زیر کاملاً مشخص است که بیان ژن ویسفاتین بافت چرب در موش‌های گروه 4 ساعت پس از تمرین تفاوت معنی‌داری با موش‌های گروه کنترل دارد. بررسی نیمه‌کمی باندها با استفاده از نرم‌افزار UVITEC انجام و نسبت بیان ژن ویسفاتین به بیان ژن بتا اکتین محاسبه گردید.
نمودار 4-3- درصد بیان ژن ویسفاتین بافت چرب نسبت به بتا اکتین در هر یک از نمونههای کنترل و کشتار 4 ساعت پس از تمرین
جدول 4-4- نتایج آزمون تی مستقل در گروه‌های کنترل و 4 ساعت پس از تمرین
348/0
717/2 –
026/0 ⃰
854/5
036/0 ⃰
با استفاده از آزمون تی مستقل مشخص شد که اختلاف معنی‌داری در بیان ژن ویسفاتین گروه‌های 4 ساعت پس از تمرین و گروه کنترل وجود دارد (026/0=p، 995/0=F، 717/2 – = t) (جدول 4-4). بنابراین فرضیه صفر مورد آزمون رد شده و فرض آزمون پذیرفته می‌شود (جدول 4-4).
نمودار 4-4- درصد بیان ژن ویسفاتین نسبت به بتااکتین گروه کشتار 4 ساعت پس از تمرین در مقایسه با گروه کنترل
چنانچه از جدول بالا مشخص است فرض صفر، رد میشود. به عبارت دیگر اختلاف معنی‌داری در بیان ژن ویسفاتین گروه‌ 4 ساعت پس از تمرین و گروه کنترل وجود دارد.
4-3-1-3- فرضیه سوم
بین بیان ژن ویسفاتین بافت چرب احشایی گروه کنترل و گروه 24 ساعت پس از تمرین، بعد از یک جلسه تمرین هوازی حاد تفاوت معنی‌داری وجود ندارد.
با توجه به تصویر ژل الکتروفورز و جدول زیر کاملاً مشخص است که بیان ژن ویسفاتین بافت چرب در موش‌های گروه 24 ساعت پس از تمرین تفاوت معنی‌داری با موش‌های گروه کنترل دارد. بررسی نیمه‌کمی باندها با استفاده از نرم‌افزار UVITEC انجام و نسبت بیان ژن ویسفاتین به بیان ژن بتا اکتین محاسبه گردید.
نمودار 4-5- درصد بیان ژن ویسفاتین بافت چرب نسبت به بتا اکتین در هر یک از نمونههای کنترل و کشتار 24 ساعت پس از تمرین
جدول 4-5- نتایج آزمون تی مستقل در گروه‌های کنترل و 24 ساعت پس از تمرین
163/1
588/2 –
032/0 ⃰
521/6
038/0 ⃰
با استفاده از آزمون تی مستقل مشخص شد که اختلاف معنی‌داری در بیان ژن ویسفاتین گروه‌های 24 ساعت پس از تمرین و گروه کنترل وجود دارد (032/0=p، 163/1=F، 588/2- = t) (جدول 4-5). بنابراین فرضیه‌ صفر مورد آزمون رد شده و فرض آزمون پذیرفته می‌شود (جدول 4-5).
نمودار 4-6- درصد بیان ژن ویسفاتین نسبت به بتااکتین گروه کشتار 24 ساعت پس از تمرین در مقایسه با گروه کنترل
چنانچه از جدول بالا مشخص است فرض صفر، رد میشود. به عبارت دیگر اختلاف معنی‌داری در بیان ژن ویسفاتین گروه‌ 24 ساعت پس از تمرین و گروه کنترل وجود دارد.
فصل پنجم ـ بحث و نتیجه‌گیری
در این فصل ابتدا به بیان خلاصهای از نحوه اجرای پژوهش و نتایج پژوهش پرداخته میشود و سپس در مورد نتایج و علل تغییرات مشاهده‌شده بحث میشود و با توجه به این که درجستجوی‌های انجام‌شده، پیشینه تحقیقات کاملاً مشابه‌ای مشاهده نشده است، لذا نتایج این پژوهش با نتایج سایر پژوهش‌های حدوداً مرتبط و انجام‌گرفته در مورد ویسفاتین و فعالیت ورزشی مقایسه خواهند شد. در خاتمه بخش‌های نتیجه‌گیری و پیشنهادات ارائه شده است.
5-2- خلاصه پژوهش
هدف کلی این پژوهش، مطالعه تاثیر یک جلسه تمرین هوازی روی نوارگردان بر میزان بیان ژن ویسفاتین بافت چرب احشایی موشهای نر دیابتی‌شده توسط استرپتوزوتوسین بود. بعد از هماهنگی‌های اولیه، 20 سر موش صحرایی نر بالغ 2 ماهه نژاد ویستار از مرکز انیستیتو پاستور آمل خریداری شد. پس از انتقال آزمودنی‌ها به محیط آزمایشگاه، به مدت یک هفته جهت تطابق با محیط جدید و همچنین در طی دوره پژوهش به‌صورت گروه‌های 5 تایی در قفس پلی‌کربنات شفاف و در محیطی با دمای 20 تا 24 درجه سانتی‌گراد، رطوبت نسبی 45 تا 55 درصد و چرخه تاریکی روشنایی 12:12 ساعته نگهداری شدند. در طی دوره پژوهش، حیوانات به‌وسیله غذای ساخت شرکت بهپرور به صورت پلت تغذیه شدند و ضمناً آب مورد نیاز حیوان نیز به‌صورت آزاد و از طریق بطریهای ویژه، در دسترس قرار داده شد. این حیوانات پس از انتقال به محیط آزمایشگاه و آشنایی با محیط جدید و نحوه فعالیت روی نوارگردان، به‌طور تصادفی به 4 گروه

92