تمرين، ويسفاتين، بيان، ویسفاتین، اين

A احتمالي و 1 میکرولیتر بافر 10X تا رسیدن به حجم نهایی10 میکرولیتر اضافه شد. سپس انکوبه‌کردن تيوب‌ها در دمای ۳۷ درجه سانتي‌گراد به مدت ۳۰ دقيقه و اضافه‌کردن يک میکرولیتر EDTA و انکوبه‌کردن آن در دماي ۶۵ درجه به مدت ۱۰ دقيقه انجام گرفت. بعد، افزودن يک میکرولیتر هگزامر تصادفي79 به ميكروتيوب‌ها و انكوباسيون آن در دماي۷۰ درجه سانتي‌گراد به مدت ۵ دقيقه صورت گرفت. اين مرحله باعث دناتوره‌شدن RNA و از بين رفتن ساختارهاي ثانويه آن مي‌گردد. بلافاصله پس از انتقال تیوب‌ها به روی یخ، مواد RNasin 5/0 میکرولیتر، مخلوط10 ميلي‌مول dNTP و 20 واحد آب عاری از RNase به ترتیب اضافه گردید. در مرحله بعدی، انكوباسيون مخلوط واكنش به مدت ۵ دقيقه در دماي ۳۷ درجه سانتي‌گراد در دستگاه ترمال سايكلر انجام شد. سپس، اضافه‌کردن یک میکرولیتر آنزیم RT، انكوباسيون مخلوط واكنش به مدت ۶۰ دقيقه در دماي ۴۲ درجه سانتي‌گراد در دستگاه ترمال سايكلر انجام گرفت. حرارت‌دادن در دماي ۷۰ درجه سانتي‌گراد به مدت ۱۰ دقيقه در دستگاه ترمال سايكلر، جهت غيرفعالسازي آنزيم RT و دناتوره‌شدن كمپلكس RNA-cDNA صورت گرفت.
3-11-1-2- مراحل انجام PCR
تکثیر قطعات ژن‌های ويسفاتین و بتا اکتین توسط روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)80 با جفت پرایمرهای طراحی‌شده انجام گرفت (جدول 3-1). محلول واکنش PCR با حجم نهایی 25 ميکروليتر شامل 100 نانوگرم DNA ژنومی، Pmol40 از هر یک از پرایمرها، 5/1 ميلي‌مولMgCl2 ، 2/0 ميلي‌مول dNTP و 25/0 واحد از آنزیم Taq پلیمراز تهیه شد. تکثیر قطعه مورد نظر در دستگاه ترموسایکلر (شرکت کوربت81، کشور استرالیا( طبق برنامه ذیل انجام گرفت. برای تشخیص محصولات PCR، قطعات تکثیریافته به روش الکتروفورز در ژل آگارز 2% قابل تفکیک بودند. پس از الکتروفورز، ژل آگارز به مدت 10 دقیقه در µgr/dl1 از محلول اتیدیوم بروماید قرار گرفت و قطعات DNA با دستگاه ژل‌خوان (شرکت اپتيکو82، کشور هلند( بررسی شدند.
جدول 3-1. مراحل انجام PCR
درجه حرارت (سانتي‌گراد)
تعداد چرخه
واسرشتگي
10 دقيقه
يک
45 ثانيه
جفت‌شدن
يک دقيقه
طويل‌شدن
طويل‌شدن نهايي
5 دقيقه
بتا اکتين يک ژن هميشه بيان‌شونده است و میتواند شاهد خوبي براي بررسي کل فرايند تخليص mRNA باشد. بیان ژن ويسفاتين، از طریق تخليصmRNA بافت با استفاده از روش گوانيدنیم تيوسيانات83، جداسازی mRNA با استفاده از كيت84 طبق دستورالعمل داده شده و سپس سنتز cDNA از آن و در نهايت تعیین سطوح نسبی بيان ژن با استفاده از روش نيمه‌كمی RT-PCR انجام گرديد. از هر يک از موش‌ها، يک ميکروگرمmRNA برای ساخت اولین رشته cDNA به کار رفت. در اين مطالعه براي ساخت cDNA از پرایمر الیگو dT در دمای 42 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت استفاده شد و کيت مزبور از شرکت فرمنتاز85 آلمان خريداري شده بود. سطح نسبي mRNAژن ويسفاتين با روش RT-PCRنيمه‌کمی اندازه‌گيري شد. پرايمرهاي ويژه ويسفاتين عبارت‌اند از:
For-vis 5`-ACCAACTGGATTGAGACTATTC-3`
Length: 22
Rev-vis P: 5`-GACTCCTCTGTAGCCGAAG-3`
Length: 19
پرايمرهاي ويژه بتا اکتين برای تکثیر اين ژن به عنوان کنترل به کار رفت. اين پرايمرها عبارت‌اند از:
Forward-beta-act: 5`- TTGTAACCAACTGGGACCCCCGATATG-3` (27 bp)
Reverse-beta-act: 5`- CGCTCTTGCCGATAGTGATG-3` (20 bp)
مقدار پلاسمایی ويسفاتين از طریق روش ELISA با استفاده از کيت Cusabio Biothech ساخت کشور چين اندازهگیری شد.
3-11-2- نحوه آماده‌سازی بافت‌ها
100 میلی‌گرم بافت در يک میلی‌لیتر بافر فسفات سالین (PBS 0.1M) توسط دستگاه هموژنایزر(Potter Elvejheim) به مدت 6 ثانیه با 8000 دور در دقيقه سردشده با یخ، هموژن شد. سپس به مدت 10 دقیقه با 3000 دور در دقيقه و در دمای 4 درجه سانتي‌گراد سانتریفوژ گردید. پس از آن مایع رویی جدا گشته و جهت اندازه‌گیری ويسفاتین مورد استفاده قرار گرفت.
3-11-3- روش‌هاي تعيين غلظت متغیرهای تحقیق
غلظت ويسفاتین با استفاده از كيت مخصوص اندازه‌گيري ويسفاتین به روش الايزا و بر اساس دستورالعمل کارخانه سازنده کيت (USCN LIFE Science Inc، ساخت کشور چین، ضریب تغییرات برون‌آزمون86 1/7 درصد، حساسیت روش اندازه‌گیری87 ng/ml 08/0) تعيين گردید.
غلظت گلیکوژن نیز با استفاده از کیت Glycogen Colorimetric ساخت کشور چین با ضریب تغییرات 5/4 و حساسیت mg/ml09/0 اندازه‌گیری شد.
غلظت گلوکز پلاسما با روش آنزیمی ـ رنگ‌سنجی با فنآوری گلوکزاکسیداز و با استفاده از کیت گلوکز (شرکت پارس آزمون، ایران) اندازهگیری شد. ضریب تغییرات و حساسیت روش اندازهگیری به ترتیب 8/1 درصد و 5 میلیگرم بر دسیلیتر بود. غلظت گليکوژن کبد با استفاده از کيت رنگ‌سنجی گليكوژن (ساخت شركت نانجينگ چين) با ضريب تغییرات 5/4 درصد و حساسیت 09/0 میلیگرم بر میلیلیتر اندازهگیری شد.
جهت سنجش غلظت پلاسمایی HDL-C و کلسترول از روش آنزیمی ـ فتومتریک (شرکت پارس آزمون، ایران) و تریگلیسیرید از روش آنزیمی ـ رنگ‌سنجی (شرکت پارس آزمون، ایران) استفاده شد. غلظت اسیدهای چرب آزاد نیز از روش آنزیمی ـ رنگ سنجی (Wako chemicals GmbH) اندازهگیری شد. برای تعیین غلظت LDL-C از روش محاسباتی فریدوالد و همکاران88 استفاده شد. ضریب تغییرات برون‌آزمونی و حساسیت روش اندازهگیری به ترتیب برای HDL-C، 2/2 درصد و يک میلیگرم بر دسیلیتر؛ کلسترول، 2/1 درصد و 3 میلیگرم بر دسیلیتر؛ تری‌گلیسیرید، 4/2 درصد و يک میلیگرم بر دسیلیتر و NEFA، 1/3 درصد و 1/0 میلیگرم بر دسیلیتر بود.
3-12- روش تجزیه و تحلیل آماری دادهها
براي دسته‌بندي و تعيين شاخصهاي پراكندگي از آمار توصيفي (با استفاده از نرم افزار 19 (spss و از برنامه اکسل89 نيز براي رسم نمودار استفاده شد. و با توجه به اینکه آزمون کلموگروف- اسمیرنف نشان داد، که داده‌ها از توزیع طبیعی برخوردارند، لذا از آمار پارامتریک برای آزمون آماری فرضیه‌ها استفاده شده است. همچنین برای مقایسه میانگین بین دو گروه کنترل و تمرین از آزمون t مستقل90 استفاده گردید. در این بررسی‌ها مقدار معنی‌داری در سطح 05/0 P تعیین شد و مقدار P برابر و یا کمتر از 05/0 به معنای رد فرض صفر قلمداد گشت.
فصل چهارم ـ تجزيه و تحليل يافته‌هاي پژوهش
در اين فصل ابتدا با استفاده از آمار توصيفي، نتايج توصيفي متغيرهاي وابسته پژوهش در قالب جدول و نمودار ارائه شده است و سپس تأثير متغير مستقل بر متغيرهاي وابسته در هر يك از گروههاي پ‍ژوهش شامل گروههاي تمريني و گروه كنترل مورد بررسي قرار ميگيرد. علاوه بر اين هر يك از فرضيههاي ارائه شده در فصل اول با استفاده از آزمونهاي آماري مناسب مورد تجزيه و تحليل قرار گرفته است.
4-2- تجزيه و تحليل توصیفي دادهها
4-2-1- بیان ژن ویسفاتین بافت چرب در گروه‌های مختلف
جدول 4-1، بيان ژن ويسفاتين را در گروه‌هاي مختلف نشان مي‌دهد. با توجه به جدول 4-1، بيان ويسفاتين در بافت چرب احشايي در گروه‌هاي تمرين نسبت به گروه کنترل افزايش داشته است.
جدول 4-1 – بیان ژن ویسفاتین نسبت به بتااکتین در گروه‌های مختلف
متغیر
گروه بلافاصله
گروه 4 ساعت
گروه 24 ساعت
ویسفاتین بافت چرب/ بتا اکتین ( درصد)
02/9 ± 55/28
29/14± 78/29
20/18 ± 24/53
15/15 ± 97/48
شکل 4-1- تصوير ژل الكتروفورز ژن بتا اكتين و ویسفاتین در موشهاي كنترل، M مارکر میباشد.
شکل 4-2- تصوير ژل الكتروفورز ژن بتا اكتين و ویسفاتین گروه بلافصله پس از تمرين، M مارکر میباشد.
شکل 4-3- تصوير ژل الكتروفورز ژن بتا اكتين و ویسفاتین گروه 4 ساعت بعد از تمرین، M مارکر میباشد.
شکل 4-4- تصوير ژل الكتروفورز ژن بتا اكتين و ویسفاتین گروه 24 ساعت بعد از تمرین، M مارکر میباشد.
چنانچه از شكلهاي فوق مشخص است، ‌ژن بتااكتين كه به عنوان كنترل تكثير ژن ویسفاتین بكار رفته، در تمام نمونهها بيان شده است. بيان ژن ویسفاتین در بافتهاي تمام موشهاي گروه كنترل و تجربي به وضوح ديده ميشود.
4-2-2- توصیف سایر متغیرهای پژوهش
در اين بخش، اطلاعات توصيفي (ميانگين و انحراف استاندارد) به‌دست آمده از متغيرهاي مورد مطالعه در هر 4 گروه تحقیق در قالب جدول ارائه شده است. در جدول 4-2 غلظت پلاسمايي ويسفاتين و ديگر متغيرها ارايه شده‌اند که به شرح زير مي‌باشد:
غلظت ويسفاتين بافت چرب در گروه‌هاي تمريني بلافاصله و 4 ساعت پس از تمرين افزايش داشته که در گروه تمريني 24 ساعت پس از تمرين کاهش يافته است.
سطوح پلاسمايي ويسفاتين در تمام گروه‌هاي تمريني نسبت به گروه کنترل افزايش داشته است.
سطوح گلوکز پلاسما در گروه‌هاي تمريني نسبت به گروه کنترل کاهش داشته است که اين کاهش‌ها معني‌دار نبودند.
سطوح HDL پلاسمايي در گروه بلافاصله پس از تمرين افزايش معني‌داري را نشان داده است اما در گروه‌هاي 4 ساعت و 24 ساعت پس از تمرين پس از تمرين کاهش غير معني‌داري داشته است.
سطوح LDL پلاسمايي در تمام گروه‌هاي تمريني نسبت به گروه کنترل افزايش غير معني‌داري را نشان داده‌اند.
سطوح کلسترول تام (TC) در گروه تمرين بلافاصله نسبت به گروه کنترل افزايش غيرمعني‌دار داشته اما در گروه‌هاي 4 و 24 ساعت پس از تمرين کاهش غيرمعني‌دار را نشان داده است.
سطوح تري‌گليسيريد پلاسمايي در تمامي گروه‌هاي تمريني نسبت به گروه کنترل کاهش غيرمعني‌داري را نشان داده است.
سطوح اسيدهاي چرب استريفه‌نشده در گروه هاي بلافاصله و 24 ساعت پس از تمرين نسبت به گروه کنترل بالاتر بوده که در گروه بلافاصله، اين افزايش معني‌دار بوده است، اما در گروه 4 ساعت پس از تمرين، سطوح اسيدهاي چرب استريفه‌نشده، کاهش غيرمعني‌داري داشته است.
ميزان گليکوژن در گروه‌هاي بلافاصله و 4 ساعت پس از تمرين کاهش داشته که اين ميزان در گروه 4 ساعت معني‌دار نبوده است و در گروه 24 ساعت پس از تمرين، اين مقدار افزايش غيرمعني دار را نشان داده است.
جدول 4-2- تغییرات پارامترهای اندازه‌گیری شده گروه‌های تحقیق (انحراف استاندارد ± ميانگين)
گروه
متغير
بلافاصله پس از تمرين
4 ساعت پس از تمرين
24 ساعت پس از تمرين
غلظت ويسفاتين بافت چرب
(نانو گرم/ گرم)
85/50 ± 78/1077
60/118± 65/1201 *
24/81± 30/1308 *
15/167± 46/1070
ويسفاتين پلاسما
(نانو گرم/ ميلي‌ليتر)
74/23 ± 56/37
82/4 ± 60/12 *
89/10 ± 38/15 *
55/14 ± 18/17 *
گلوکز (میلیگرم بر دسیلیتر)
5/24 ± 0/412
5/37 ± 8/340
4/68 ± 4/360
9/76 ± 0/382
HDL (میلیگرم بر دسیلیتر)
6/5 ± 1/29
1/6 ± 2/38 *
2/3 ± 0/28
5/4 ± 3/27
LDL (میلیگرم بر دسیلیتر)
5/3 ± 5/78
6/23 ± 4/80
3/9 ± 8/82
2/16 ± 3/80
TC (میلیگرم بر دسیلیتر)
0/9 ± 8/130
9/18 ± 6/135
6/15 ± 4/130
7/12 ± 8/128
TG (میلیگرم بر دسیلیتر)
9/44 ± 8/115
9/11 ± 2/85
6/41 ± 8/97
3/40 ± 8/105
NEFA (میلیگرم بر دسیلیتر)
25/1 ± 57/4
98/0 ± 64/6 *
58/0 ± 41/4
54/0 ± 96/4
گلیکوژن کبد (میلیگرم بر گرم)
069/0 ± 30/0
033/0 ± 24/0 *
014/0 ± 27/0
025/0 ± 31/0
* (05/0 P≤)
4-3- تجزيه و تحليل استنباطي يافتههاي پژوهش
در این قسمت فرضیه‌های تحقیق مورد آزمون قرار میگیرد. تمام فرضیههای تحقیق در سطح معني‌داری (05/0P≤) ارزیابی شده‌اند. براي آزمون توزيع طبيعي داده‌هاي از آزمون کولموگراف اسميرنف و برای آزمون فرضیهها از آزمون تي مستقل استفاده شده و نتایج در جداول مربوطه ارائه گردیده است.
4-3-1- آزمون فرضيههاي پژوهش
4-3-1-1- فرضيه اول
بين بيان ژن ويسفاتين بافت چرب احشايي گروه کنترل و گروه بلافاصله پس از تمرين، بعد از يک جلسه تمرين هوازي حاد تفاوت معني‌داري وجود ندارد.
با توجه به تصویر ژل الکتروفورز و جدول زیر کاملاً مشخص است که بیان ژن ویسفاتین بافت چرب در موش‌های گروه بلافاصله تفاوت معنی‌داری با موش‌های گروه کنترل ندارد. بررسي نيمه‌کمي باندها با استفاده از نرم‌افزار UVITEC انجام و نسبت بیان ژن ویسفاتین به بيان ژن بتا اکتين محاسبه گرديد.
نمودار 4-1- درصد بيان ژن ويسفاتین بافت چرب نسبت به بتا اكتين در هر يك از نمونههاي كنترل و کشتار بلافاصله پس از تمرين
جدول 4-3- نتایج آزمون تي مستقل در گروه‌های کنترل و بالافاصله پس از تمرين
آزمون لون
درصد بيان ژن ويسفاتین بافت چرب نسبت به بتا اكتين
با فرض برابري واريانس
163/0 –
با فرض عدم برابري واريانس
752/6
با استفاده از آزمون تي مستقل مشخص شد که اختلاف معنی‌داری در بیان ژن ويسفاتين گروه‌های بلافاصله پس از تمرين و گروه کنترل وجود ندارد (875/0=p، 444/0=F، 163/0 – = t) (جدول 4-3).
نمودار 4-2- درصد بيان ژن ویسفاتین نسبت به بتااکتین گروه بلافاصله در مقايسه با گروه کنترل
چنانچه از جدول بالا مشخص است فرض صفر، پذیرفته میشود. به عبارت ديگر اختلاف معنی‌داری در بیان ژن ويسفاتين گروه‌ بلافاصله پس از تمرين و گروه کنترل وجود ندارد.
4-3-1-2- فرضيه دوم
بين بيان ژن ويسفاتين بافت چرب احشايي گروه کنترل و گروه 4 ساعت پس از تمرين، بعد از يک جلسه تمرين هوازي حاد تفاوت معني‌داري وجود ندارد.
با توجه به تصویر ژل الکتروفورز و جدول زیر کاملاً مشخص است که بیان ژن ویسفاتین بافت چرب در موش‌های گروه 4 ساعت پس از تمرين تفاوت معنی‌داری با موش‌های گروه کنترل دارد. بررسي نيمه‌کمي باندها با استفاده از نرم‌افزار UVITEC انجام و نسبت بیان ژن ویسفاتین به بيان ژن بتا اکتين محاسبه گرديد.
نمودار 4-3- درصد بيان ژن ويسفاتین بافت چرب نسبت به بتا اكتين در هر يك از نمونههاي كنترل و کشتار 4 ساعت پس از تمرين
جدول 4-4- نتایج آزمون تي مستقل در گروه‌های کنترل و 4 ساعت پس از تمرين
348/0
717/2 –
026/0 ⃰
854/5
036/0 ⃰
با استفاده از آزمون تي مستقل مشخص شد که اختلاف معنی‌داری در بیان ژن ويسفاتين گروه‌های 4 ساعت پس از تمرين و گروه کنترل وجود دارد (026/0=p، 995/0=F، 717/2 – = t) (جدول 4-4). بنابراين فرضيه صفر مورد آزمون رد شده و فرض آزمون پذيرفته مي‌شود (جدول 4-4).
نمودار 4-4- درصد بيان ژن ویسفاتین نسبت به بتااکتین گروه کشتار 4 ساعت پس از تمرين در مقايسه با گروه کنترل
چنانچه از جدول بالا مشخص است فرض صفر، رد میشود. به عبارت ديگر اختلاف معنی‌داری در بیان ژن ويسفاتين گروه‌ 4 ساعت پس از تمرين و گروه کنترل وجود دارد.
4-3-1-3- فرضيه سوم
بين بيان ژن ويسفاتين بافت چرب احشايي گروه کنترل و گروه 24 ساعت پس از تمرين، بعد از يک جلسه تمرين هوازي حاد تفاوت معني‌داري وجود ندارد.
با توجه به تصویر ژل الکتروفورز و جدول زیر کاملاً مشخص است که بیان ژن ویسفاتین بافت چرب در موش‌های گروه 24 ساعت پس از تمرين تفاوت معنی‌داری با موش‌های گروه کنترل دارد. بررسي نيمه‌کمي باندها با استفاده از نرم‌افزار UVITEC انجام و نسبت بیان ژن ویسفاتین به بيان ژن بتا اکتين محاسبه گرديد.
نمودار 4-5- درصد بيان ژن ويسفاتین بافت چرب نسبت به بتا اكتين در هر يك از نمونههاي كنترل و کشتار 24 ساعت پس از تمرين
جدول 4-5- نتایج آزمون تي مستقل در گروه‌های کنترل و 24 ساعت پس از تمرين
163/1
588/2 –
032/0 ⃰
521/6
038/0 ⃰
با استفاده از آزمون تي مستقل مشخص شد که اختلاف معنی‌داری در بیان ژن ويسفاتين گروه‌های 24 ساعت پس از تمرين و گروه کنترل وجود دارد (032/0=p، 163/1=F، 588/2- = t) (جدول 4-5). بنابراين فرضيه‌ صفر مورد آزمون رد شده و فرض آزمون پذيرفته مي‌شود (جدول 4-5).
نمودار 4-6- درصد بيان ژن ویسفاتین نسبت به بتااکتین گروه کشتار 24 ساعت پس از تمرين در مقايسه با گروه کنترل
چنانچه از جدول بالا مشخص است فرض صفر، رد میشود. به عبارت ديگر اختلاف معنی‌داری در بیان ژن ويسفاتين گروه‌ 24 ساعت پس از تمرين و گروه کنترل وجود دارد.
فصل پنجم ـ بحث و نتيجه‌گيري
در این فصل ابتدا به بیان خلاصهای از نحوه اجرای پژوهش و نتایج پژوهش پرداخته میشود و سپس در مورد نتایج و علل تغییرات مشاهده‌شده بحث میشود و با توجه به اين که درجستجوي‌هاي انجام‌شده، پيشينه تحقيقات کاملاً مشابه‌اي مشاهده نشده است، لذا نتايج اين پژوهش با نتايج ساير پژوهش‌هاي حدوداً مرتبط و انجام‌گرفته در مورد ويسفاتين و فعاليت ورزشي مقایسه خواهند شد. در خاتمه بخش‌هاي نتیجه‌گیری و پیشنهادات ارائه شده است.
5-2- خلاصه پژوهش
هدف كلي اين پژوهش، مطالعه تاثير يك جلسه تمرين هوازي روي نوارگردان بر ميزان بيان ژن ويسفاتين بافت چرب احشايي موشهاي نر ديابتي‌شده توسط استرپتوزوتوسين بود. بعد از هماهنگی‌های اولیه، 20 سر موش صحرایی نر بالغ 2 ماهه نژاد ویستار از مرکز انیستیتو پاستور آمل خریداری شد. پس از انتقال آزمودنی‌ها به محیط آزمایشگاه، به مدت یک هفته جهت تطابق با محیط جدید و همچنین در طی دوره پژوهش به‌صورت گروه‌های 5 تایی در قفس پلی‌کربنات شفاف و در محیطی با دمای 20 تا 24 درجه سانتی‌گراد، رطوبت نسبی 45 تا 55 درصد و چرخه تاریکی روشنایی 12:12 ساعته نگهداری شدند. در طي دوره پژوهش، حيوانات به‌وسیله غذاي ساخت شركت بهپرور به صورت پلت تغذیه شدند و ضمناً آب مورد نياز حيوان نيز به‌صورت آزاد و از طريق بطريهاي ويژه، در دسترس قرار داده شد. اين حيوانات پس از انتقال به محيط آزمايشگاه و آشنايي با محيط جديد و نحوه فعاليت روي نوارگردان، به‌طور تصادفي به 4 گروه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *