VNTR، TAE

دانلود پایان نامه

چهل ثانیه
دردمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۷ دقیقه

جدول ۳-۶، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس SE-10
واسرشت اولیه

۳۴ سیکل
گسترش نهای

واسرشت
اتصال
گسترش

در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت سه دقیقه

در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت سی ثانیه
در دمای ۶۰ درجه سانتی گراد به مدت سی ثانیه
در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت چهل ثانیه
در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت هفت دقیقه

جدول ۳-۷، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس SE-6

واسرشت اولیه
۳۴ سیکل
گسترش نهایی

واسرشت
اتصال
گسترش

در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت سه دقیقه
در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت سی ثانیه
در دمای ۵۲ درجه سانتی گراد به مدت سی ثانیه
در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت چهل ثانیه
در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت هفت دقیقه

۳-۴-۲- الکتروفورز محصولات VNTR
برای بررسی بررسی و مشاهده ی باند های حاصل از محصولات VNTR، الکتروفورز بر روی ژل آگارز انجام شد. مولکول های DNA به دلیل داشتن بار منفی هنگامیکه در میدان الکتریکی قرار می گیرند، به سمت قطب مثبت حرکت می نمایند. بایستی توجه داشت که از یک نوع بافر برای تهیه ژل و بافر تانک الکتروفورز استفاده گردد.مواد مورد نیاز جهت الکتروفورز بر روی ژل آگارز عبارتند از:
۱) پودر آگارز
۲) بافر۵۰X TAE
۳) Tris یک مولار
۴) اسید استیک گلاسیال
۵) EDTA نیم مولار
۶) رنگ اتیدیوم برماید شرکت آواژن
۷) بافر سنگین کننده ۱۰۶ X 6 شرکت سیناژن
برای الکتروفورز محصولات آزمون زنجیره ای پلی مراز، ابتدا نیاز به ساخت بافر TAE است. این بافر به صورت X50) مخژن) تهیه می گردد. به طور خلاصه برای تهیه آن، ابتدا ۲۴ گرم Tris-base را با ۷/۵ میلی لیتر اسید استیک گلاسیال و ۱۰ میلی لیتر محلول نیم میلی مولار EDTA (PH=8) محلوط کرده و سپس حجم محلول را با آب مقطر به ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم. برای تهیه ژل آگاروز و همچنین استفاده در تانک الکتروفورز، بایستی از محلول TAE1X استفاده کنیم بطوریکه یک میلی لیتر از محلول ۵۰X برداشته و با ۴۹ میلی لیتر آب مقطر مخلوط کرده و مورد استفاده قرار می دهیم.
جهت تهیه ژل آگاروز ۱.۵ درصد، ۱.۵ گرم آگاروز( شرکت Eurx، لهستان) را با ۱۰۰ میلی لیتر از بافر TAE 1X را داخل ارلن مخلوط کرده و بر روی شعله قرار داده و می جوشانیم. سپس پس از کمی سرد شدن، آنرا به داخل کاست حاوی شانه می افزاییم. پس از حدود نیم ساعت، ژل مورد نظر سفت شده و شانه را به آهستگی خارج می کنیم و ژل را در داخل تانک حاوی بافر TAE 1 X قرار می دهیم. سپس سه میکرولیتر از هر محصول PCR را با ۱.۵ میکرولیتر بافر سنگین کننده ( شرکت سیناژن، ایران) مخلوط می کنیم و به داخل چاهک هایی که شانه ایجاد نموده، می افزاییم. همچنین برای تعیین اندازه محصولات PCR یا آمپلیکون ها، در چاهک اول ژل، مارکر ۱۰۰bp plus( شرکت Invitrogen، آلمان) را اضافه می کنیم. سپس الکتروفورز به مدت یک ساعت در ولتاژ ۸۰ ولت انجام می گیرد. پس از اتمام الکتروفورز، ژل را از تانک خارج کرده و در داخل تانک حاوی محلول اتیدیوم برماید به مدت ۱۵ دقیقه قرار داده و سپس ژل در داخل تانک حاوی آب مقطر به مدت همان ۱۵ دقیقه قرار می دهیم. سپس ژل را از داخل تانک خارج کرده و در دستگاه ترانس ایلومیناتور( شرکت بایورد، آمریکا) در زیر نور ماورای بنفش از نظر وجود بند محصول PCR بررسی نموده و از آن عکس می گیریم.

۳-۴-۳- محاسبه ی اندازه و تعداد تکرار های VNTR
تعداد تکرار در هر لوکوس VNTR را می‌توان به راحتی پس از انجام PCR و تفکیک محصول PCR (امپلیکون) با استفاده از الکتروفورز بر روی ژل آگارز، محاسبه نمود. اگر اندازه امپلیکون یا همان محصول PCR را از مجموع مناطق دربرگیرنده چپ و راست۱۰۷ کم نماییم و عدد حاصل را بر اندازه تکرار۱۰۸ (که از قبل، توسط مقاله یا پروتوکل استاندارد در اختیار ما قرار داده شده است) تقسیم کنیم، تعداد تکرار۱۰۹ در هر لوکوس محاسبه می‌شود. علاوه بر این، برای محاسبه دقیق اندازه آمپلیکون‌ها بایستی حداقل از دو یا سه ستون سایز مارکر استفاده شود بطوریکه یکی در آخرین ستون سمت چپ، یکی در آخرین ستون سمت راست و دیگری در ستون وسط ژل قرار داده شود. در این مطالعه از سایز مارکرهای ۱۰۰ bp plus (شرکت Invitrogen، آلمان) استفاده گردید.برای آنکه بتوان باند های کوچک را خواند باید از سایز مارکر۵۰bp plus استفاده نمود. در صورت عدم تکثیر محصول VNTR، یکبار دیگر PCR برای ایزوله مزبور تکرار می‌گردد. در صورتی که بازهم هیچگونه تکثیری مشاهده نشد، الل مزبور به صورت تُهی (null) در نظر گرفته می‌شود. این امر ممکن است واقعاً به دلیل عدم وجود لوکوس VNTR و یا موتاسیون در جایگاه اتصال پرایمرها اتفاق افتاده باشد که به هر حال منجر به عدم تکثیر لوکوس VNTR خواهد شد. در ضمن، الل‌هایی که تعداد تکرار آن‌ها دارای عدد اعشاری بود، به نزدیک‌ترین عدد صحیح، گرد شدند (۲۷).

این نوشته در پایان نامه ها و مقالات ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *