مقالات

ویسفاتین، دقیقه، تمرین، که، کاهش

دانلود پایان نامه

التهابی[114] مرتبط است. چون افزایش بیان این پروتئین در ماکروفاژهای کاروتید بی‌ثبات در انسان‌ها و رابطه منفی بین سطوح پلاسمایی ویسفاتین و عملکرد اندوتلیال عروقی وجود دارد، فرض می‌شود که ویسفاتین، نقش مهمی در بی‌ثباتی پلاک‌ها ایفا می‌کند. نشان داده شده است که ویسفاتین به‌عنوان سایتوکین عمل می‌کند و بنابراین نقش مهمی در تنظیم پاسخ ایمنی ایفا می‌کند. چون ویسفاتین در پاتوژنز چندین شرایط التهابی حاد و مزمن مانند تصلب شرایین دخیل است، می‌تواند به‌عنوان سایتوکین پیش‌التهابی عمل کند و تاثیرات مفیدی بر ترشح انسولین دارد[115].
2-2-7-6- نقش ویسفاتین در متابولیسم
فوکوهارا و همکاران (2005) از طریق یک سری آزمایشات، شامل کشت سلولی، جوندگان و انسان‌ها، قلمرو ویسفاتین را در متابولیسم گلوکز و چاقی، با اثبات تاثیرات شبه‌انسولینی آن، توسعه داده‌اند[6]. علاوه بر این روولو و همکاران، ارتباط ویسفاتین با گلوکز و متغیرهای مرتبط با چاقی را به واسطه نقش آن به‌عنوان Nampt پیشنهاد کردند. آنها از طریق حفظ سطوح NMN و NAD و در نتیجه، فعالسازی عوامل مستقل از NAD مانند خانواده سیرتویین60، مکانیسم ارتباط ویسفاتین با متابولیسم و بیوسنتز NAD را پیشنهاد کردند[26, 104].
مسیر پیشنهادی روولو و همکاران (2007)، با جذب نیکوتین‌آمید از رژیم غذایی و توزیع آن به بافت‌های بدن شروع می‌شود. اگر نیکوتین‌آمید توسط سلول دریافت شود، تبدیل آن به NMN توسط Nampt درون‌سلولی تنظیم می‌شود. اگر از گردش خون خارج نشود، Nampt خارج ‌سلولی می‌تواند نیکوتین‌آمید را به NMN تبدیل کند که سپس برای مصرف به بافت منتقل می‌شود. درون سلول، NMN آدنیلیل ترنسفراز (Nmnat)61 جهت تولید NAD واکنش می‌دهد[26, 104].
چون تقسیم NAD برای واکنش‌های دی‌استیلاز62 و ریبوزیلیشن ADP63 مورد نیاز است، یکی از اهداف NAD، خانواده سیرتویین است[108]. بدون توجه به این مکانیسم، محققان زیادی نقش ویسفاتین در گلوکز و شرایط وابسته به چاقی را بررسی کرده‌اند. هر چند نتایج آنها به‌طور کامل سازگار نبوده‌اند[100, 102, 103].
ناهمخوانی مطالعات قبلی ویسفاتین تا حدودی ممکن است ناشی از طرح مطالعه باشد که نتوانستند تاثیر تمرین و رژیم غذایی را در نظر بگیرند. بنابراین مطالعاتی که سطوح ویسفاتین را بررسی می‌کنند، با در نظرگرفتن رژیم غذایی و فعالیت بدنی می‌توانند به شناسایی برخی از یافته‌های ناهمخوان گزارش‌های قبلی کمک کنند.
2-3- اثر فعالیتهای ورزشی بر غلظت ویسفاتین
2-3-1- فعالیت ورزشی کوتاه‌مدت
قنبری نیاکی و همکاران (2010) تاثیر تمرین دایرهای کیک‌بوکسورهای مرد جوان را بلافاصله پس از یک جلسه فعالیت کوتاه‌مدت بیهوازی آزمون رست64(RAST) بر سطوح ویسفاتین پلاسما بررسی کردند که با افزایش معنی‌دار ویسفاتین همراه بود. در این پژوهش، 6 مرد جوان سالم (دامنه سنی3/2±8/23، وزن 3/2 ±5/78 کیلوگرم و شاخص توده بدنی 2/1±1/22) یک جلسه فعالیت ورزشیRAST را انجام دادند. نمونه‌های خونی، قبل، بلافاصله، 45 و 90 دقیقه بعد از آزمون جمع‌آوری شد که بلافاصله پس از فعالیت ورزشی افزایش معنی‌داری در غلظت ویسفاتین پلاسما، انسولین و گلوکز مشاهده شد. اما به تدریج در طی دوره 90 دقیقه پس از فعالیت به پایینتر از سطح پایه برگشت. تغییرات انسولین الگوی مشابه با ویسفاتین را نشان داد. این تغییرات احتمالا بافتها را برای جذب گلوکز تحریک میکند که این افزایش برای بازسازی گلیکوژن ضروری است[116].
جوریما و همکاران65 در سال 2009، اثر 2 ساعت تمرین طولانی با شدت متوسط را در دوره بازگشت به حالت اولیه در مردان قایقران حرفهای، بر سطوح ویسفاتین پلاسما مورد بررسی قرار دادند که با کاهش معنیدار ویسفاتین همراه بود. 9 مرد قایقران (سن 5/1±1/20، وزن 0/5 ±0/81، درصد چربی 3/3±8/10) در دو گروه تمرین و کنترل در این آزمون شرکت کرده بودند[117]. فریدلند و همکاران66 در سال 2007 دریافتند که سه ساعت تمرین بر روی دوچرخه کارسنج با شدت 60 درصد اکسیژن مصرفی بیشینه در 15 مرد جوان سالم (میانگین سنی 4±9/24، وزن 8±82 و BMI 2±24/9) بر غلظت پلاسمایی ویسفاتین اثر ندارد. یافتههای آنها نشان داد که انجام فعالیت ورزشی باعث افزایش بیان mRNA ویسفاتین در بافت چربی زیرجلدی شکم میشود. آنها گزارش کردند که ممکن است ویسفاتین در بافت چربی زیرجلدی نقش متابولیکی در دوره برگشت به حالت اولیه داشته باشد. از سوی دیگر افزایش بیان mRNA ویسفاتین بافت چرب با سطوح ویسفاتین پلاسما همسو نبود[40].
2-3-2- فعالیت ورزشی طولانی‌مدت
بنا به گزارش جرج و همکاران67 (2011)، 12 هفته تمرین به سه روش هوازی، مقاومتی و ترکیبی (3 نوبت در هفته، 60 دقیقه در هر نوبت) در بیماران دیابت نوع 2 منجر به افزایش ویسفاتین شد اما تفاوت معنی‌داری بین گروههای تمرینی مشاهده نشد. آنها ویسفاتین را یک آدیپوکین سودمند با اثر افزاینده حساسیت انسولینی فرض کردند. یافتههای آنها نشان داد که افزایش بیان گیرنده انسولین در گروه مقاومتی 65 درصد و در گروه ترکیبی 90 درصد بود[118]. ماستو و همکاران68 اظهار داشتند که فعالیت بدنی با کاهش وزن بدن اثرات مثبتی را بر سطوح ویسفاتین خون نوجوانان ایجاد کرده است[28].
لی و همکاران69 (2010) گزارش کردند که تمرین هوازی به مدت 12 هفته، 4 جلسه در هفته، 45 تا 50 دقیقه در روز با هزینه انرژی معادل 400-300 کالری به کاهش معنی‌دار سطوح ویسفاتین پلاسمایی در نوجوانان و زنان چاق منجر شد[119]. محمدی و همکاران در سال 2010 اثر 8 هفته تمرین هوازی را بر سطوح ویسفاتین در مردان میانسال مورد بررسی قرار دادند. 19 مرد میانسال سالم (دامنه سنی 8/4± 5/38، شاخص توده بدنی 6/2± 2/25) در این پژوهش شرکت کرده بودند. برنامه تمرینی شامل 8 هفته و 3 روز در هفته با شدت80-65 درصد حداکثر ضربان قلب به مدت 34-20 دقیقه اجرا می‌شد. یافتههای آنها نشان داد که درصد چربی بدن و غلظت ویسفاتین پلاسما پس از 8 هفته تمرین هوازی به‌طور معنیداری کاهش پیدا کرد و رابطه مثبتی نیز بین ویسفاتین و سطح تریگلیسرید پلاسما و درصد چربی بدن مشاهده شد. به‌طور کلی نتایج تحقیق آنها نشان داد که انجام تمرینهای قدرتی و استقامتی میتواند به واسطه کاهش توده چربی بدن، در کاهش ویسفاتین پلاسما در مردان میان‌سال سالم و با وزن طبیعی موثر باشد و این تغییرات مستقل از بهبود سطح چربی‌های خون است[120].
هایوس و همکاران70 (2009) گزارش کردند که تمرین هوازی (12 هفته، 5 روز در هفته، 60 دقیقه در روز با 85 درصد ضربان قلب بیشینه) به کاهش وزن همراه با کاهش سطح ویسفاتین پلاسما منجر شد. یافته‌های آنها نشان داد که فعالیت ورزشی باعث تغییر در سطوح گردش خون ویسفاتین میشود و تغییر ویسفاتین با تغییر سطوح گلوکز و انسولین همراه است[42].
بریما و همکاران71 (2008) نشان دادند که 3 ماه تمرین هوازی (4 ساعت در هفته با شدت 75 درصد اکسیژن مصرفی بیشینه) سطح ویسفاتین پلاسمایی را در بیماران جوان مبتلا به دیابت نوع 2 و چاق (30-15سال) به‌طور معنیداری از 8/55 و 7/64 نانوگرم در میلیلیتر به ترتیب به 6/11 و 5/29 نانوگرم (50 تا80 درصد) کاهش داد[41]. چویی و همکاران72 نشان دادند که انجام تمرین هوازی و قدرتی با هزینه انرژی 300 (برای 45 دقیقه) و 100 کیلوکالری (برای20 دقیقه) به کاهش معنیدار ویسفاتین پلاسمایی در حالت ناشتا منجر شد. انجام تمرین هوازی توانست به واسطه کاهش وزن، در کاهش ویسفاتین پلاسمای زنان کرهای سالم مؤثر باشد[38].
هیدر و همکاران73 (2006) گزارش کردند که تمرین هوازی برای 2 و 4 ماه به‌طور معنی‌داری سطوح پلاسمایی ویسفاتین را در بیماران دیابتی کاهش داد. 18 آزمودنی (11 زن و 7 مرد مبتلا به دیابت نوع 1، دامنه سنی 10±42) و 14 نفر گروه کنترل (7 مرد و 7 زن با دامنه سنی 5±29) در این آزمون شرکت کرده بودند و اثر تمرین هوازی هدایت‌شده بر ویسفاتین، به مدت 8 ماه پس از قطع تمرین باقی ماند. این احتمال وجود دارد عوامل دیگری همچون متابولیسم گلوکز، وزن و یا نیمرخ لیپیدی، عامل کاهش ویسفاتین باشند[37].
2-4- جمع‌بندی
شواهد زیادی نشان می‌دهند که التهاب می‌تواند نقش حیاتی در پاتوژنز دیابت بازی کند، از این‌رو تصور می‌شود رابطه دیابت با تعدادی از شرایط همزیستی معمولی از طریق مکانیسم‌های التهابی نشات بگیرد. در این خصوص چندین مدرک آزمایشگاهی اساسی نشان می‌دهند که رزیستین و ویسفاتین، دو آدیپوکینی که به مقدار زیادی در افراد چاق و دیابتی نسبت به افراد لاغر و سالم بیان می‌شود، با هایپرگلیسمی، مقاومت انسولین و دیابت نوع 2 آشکار مرتبط هستند.
تحقیقات مقطعی گزارش‌های متناقضی از نقش ویسفاتین گزارش داده‌اند که ممکن است در التهاب و علت‌شناسی دیابت نوع 2 بازی کند. بنابراین آزمایش‌های بیشتری لازم است تا نقش پاتوفیزیولوژیکی و فیزیولوژیکی ویسفاتین روشن‌تر شود.
فصل سوم ـ روش‌شناسی پژوهش
همانگونه که در فصلهای پیش عنوان شد، هدف از این پژوهش، بررسی تغییرات بیان ژن ویسفاتین بافت چربی احشایی در پاسخ به یک جلسه فعالیت ورزشی هوازی حاد در موشهای صحرایی دیابتی بوده است. از آنجا که دقت در جمعآوری اطلاعات و استفاده صحیح از ابزارهای اندازهگیری و به‌کارگیری روش صحیح اجرای تحقیق، قابلیت تکرارپذیری یافتهها را افزایش میدهد، در همین راستا در این فصل به شرح و توضیح روش‌شناسی تحقیق شامل روش تحقیق، جامعه آماری مورد پژوهش، نحوه انتخاب نمونهها، ابزار و وسایل اندازه‌گیری متغیرهای تحقیق و روش تجزیه و تحلیل دادهها خواهیم پرداخت.
با توجه به اینکه آزمودنیهای تحقیق را موشهای صحرایی آزمایشگاهی نژاد ویستار با گروههای سنی مشابه تشکیل میدادند که در یک طرح تحقیقی حاد مورد بررسی قرار گرفتند، لذا تحقیق حاضر از نوع تجربی است.
3-3- نمونه آماری
تعداد 20 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار از انستیتوپاستور آمل خریداری و به اتاق حیوانات آزمایشگاه زیست‌شناسی دانشگاه مازندران انتقال یافتند. نمونه‌ها پس از یک هفته آشنایی با محیط آزمایشگاه، دیابتی شدند. نمونهها به روش تصادفی ساده به دو گروه دیابتی تمرین (DT) (15 سر) و دیابتی کنترل (DC) (5 سر) تقسیم شدند. همچنین گروه دیابتی تمرین شامل بلافاصله پس از تمرین (5 سر)، 4 ساعت پس از تمرین (5 سر)، 24 ساعت پس از تمرین (5 سر) بود. از آنجا که وزن حیوانات دقیقاً یکسان نبود، لذا برای یکسان‌سازی گروهها به لحاظ وزنی، ابتدا آزمودنیها وزنکشی شده و در قفسهای با تفاوت وزنی 5 گرم دسته‌بندی شدند. سپس هر یک از قفسها با دستهبندی وزنی مشخص، یک موش به‌طور تصادفی انتخاب شده و در گروههای اصلی قرار داده شد. بر این اساس، وزن موشهای گروههای مختلف پس از دسته‌بندی پژوهش به طور متوسط 5±165گرم بود. سن همه آزمودنیها 8-6 هفته بود.
3-4- نحوه نگهداری و تغذیه نمونهها
موشهای مورد آزمایش در این پژوهش در گروههای پنج‌تایی و در قفسهای مجزا از جنس پلی‌کربنات به ابعاد47×27×20 سانتیمتر با درب توری نگهداری شدند. دمای محیط 4/1±22 درجه سانتی‌گراد و چرخه روشنایی به تاریکی 12:12 ساعت و رطوبت هوا 4±6/55 درصد بود.
موشهای صحرایی با غذاهای تولیدی مراکز تولید خوراک دام که به صورت پلت74 میباشد تغذیه شدند. همچنین آب مورد نیاز هر حیوان در بطری آب 500 میلی‌لیتری ویژه حیوانات آزمایشگاهی در اختیار آن‌ها قرار داده شد. آزمودنیها به آب و غذا دسترسی آزاد داشتند.
3-5- نحوه دیابتی‌کردن آزمودنیها و تزریق استرپتوزوتوسین
دیابتی‌کردن موشها از طریق تزریق درون‌صفاقی استرپتوزوتوسین75 حل‌شده در بافر سیترات 1/0 مولار به میزان 50 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن انجام گرفت. یک هفته پس از تزریق ماده مذکور خون‌گیری از سینوس چشمی موش‌ها در حالت ناشتا انجام شد. نمونه خون پس از جمع‌آوری در میکروتیوب‌های استریل به آزمایشگاه انتقال داده شد. به منظور تعیین دیابتیشدن موشها، گلوکز خون آن‌ها اندازهگیری و سطوح گلوکز خون بالای 30 میلی‌مول به عنوان دیابتی شناسایی شدند.
3-6- برنامه تمرین آزمودنیها
برنامه تمرینی به دو مرحله تقسیم شد:
مرحله اول: مرحله آشناسازی با تردمیل مخصوص جوندگان؛ پس از اطمینان از دیابتی‌شدن، آزمودنی‌ها را در دستگاه نوارگردان مخصوص جوندگان قرار داده و به مدت یک هفته هر روز به مدت 15-10 دقیقه با سرعت 10 متر بر دقیقه راه رفتند.
مرحله دوم: مرحله آزمون نهایی؛ آزمودنیها در یک جلسه به مدت 1 ساعت و با سرعت 20 متر در دقیقه با شیب صفر درجه دویدند (از مجموع 60 دقیقه فعالیت، 10 دقیقه به گرم‌کردن اختصاص یافت).
3-7- روش‌ گردآوری اطلاعات و وسایل اندازهگیری
3-7-1- وسایل اندازهگیری
• قفس پلیکربنات به ابعاد47×27×20 سانتیمتر برای نگهداری موش و ظرف آب مخصوص
• غذای مخصوص موش (پلت) تهیه شده از انستیتو آمل
• سرنگ انسولینی(یک سی‌سی)
• دماسنج جیوه‌ای
• سانتریفوژ 8000 دور در دقیقه
• وسایل تشریح (پنس، قیچی جراحی، تیغ و دسته اسکارپل مخصوص جراحی استریل)
• وسایل آزمایشگاهی: لوله آزمایش، میکروتیوب، شیشه ساعت، PH سنج
• هاون چینی برای پودرکردن
• ماده بیهوشی مخلوطی از دو ماده زایلازین و کتامین76
• اتانول 96 درصد
• استروپتوزتوسین
• کیت الایزا برای اندازه‌گیری ویسفاتین
• آب مقطر
• مایع نیتروژن
• محلول بافر
• یخچال 80– درجه سانتی‌گراد ساخت کشور ایتالیا
• تانک 7 کیلویی نیتروژن مایع ساخت کشور آمریکا
• دستگاه نوارگردان بدون شیب ویژه جوندگان (ساخت دانشکده تربیت بدنی دانشگاه مازندران)
• زمانسنج دیجیتالی (Jemis-Japan) با دقت 01/0 ثانیه جهت ثبت زمان
• ترازوی دیجیتالی با حساسیت 01/0 گرم (ساخت شرکت سارتاریاس77 آلمان)
3-7-2- اندازه‌گیری وزن آزمودنی‌ها
برای اندازهگیری وزن موشها از ترازوی دیجیتالی با حساسیت 01/0 گرم استفاده شد. موشها در ابتدای ورود و در انتهای تحقیق وزن شدند.
3-8- متغیرهای تحقیق
3-8-1- متغیرهای مستقل
متغیر مستقل این تحقیق عبارت بود از تمرین هوازی با شدت 20 متر بر دقیقه به مدت 60 دقیقه بر روی نوارگردان در شرایط آزمایشگاه.
3-8-2- متغیر وابسته
بیان ژن ویسفاتین بافت چرب احشایی
3-8-3- متغیر کنترل
دیابت و جنسیت
3-9- روش بیهوش‌کردن آزمودنیها، جمع‌آوری و نگهداری بافتها و پلاسما
آزمودنیها بلافاصله، 4 و 24 ساعت پس از فعالیت با تزریق درون‌‌صفاقی ترکیبی از کتامین (mg/kg70) و زایلازین (mg/kg5-3) بیهوش شدند. سپس با برش در ناحیه شکم و قفسه سینه، با سرنگ به میزان10 میلیلیتر خون از قلب کشیده شد و در لولههای حاوی EDTA78ریخته شد. نمونههای جمعآوری شده سریعاً به مدت10 دقیقه و با سرعت2800 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید. پلاسمای بهدست آمده در اپندورف‌های شماره‌گذاری شده ریخته شدند. بافت چربی احشایی نیز سریعاً جدا و پس از شستشو با سرم فیزیولوژیک در میکروتیوبهای عاری از RNAase و DNAase (جهت جلوگیری از هر گونه آلودگی برای انجام تخلیص mRNA و RT-PCR) قرار داده شد و فورا در نیتروژن مایع منجمد گردیدند. پس از آن نمونه‌ها جهت مراحل بعدی تحقیق به فریزر با دمای 80- درجه سانتیگراد انتقال یافتند.
3-10- هموژن‌کردن بافتها
برای هموژنکردن بافت مراحل زیر انجام شد:
1) بافت مورد نظر از فریزر خارج و با استفاده از ترازوی دیجیتال با دقت 01/0 گرم وزنکشی شد.
2) بافت داخل لوله آزمایش 15 قرار داده شد و به نسبت هر 5/0گرم بافت مقدار 200 لاندا از محلول لیزکننده تک‌فازی روی آن ریخته شد.
3) برای حفظ پروتئینهای بافت، آپروتینین به آن اضافه گردید.
4) با استفاده از هموژنایزر به مدت پنج دقیقه با سرعت 8000 دور در دقیقه بافت هموژن گردید.
5) محلول به‌دستآمده به مدت 15 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید.
6) محلول رویی توسط سمپلر به داخل میکروتیوب منتقل و رسوب باقیمانده دور ریخته شد.
3-11- روشهای آزمایشگاهی و اندازهگیری متغیرها
3-11- 1- روش تعیین بیان ژن ویسفاتین
3-11-1-1- مراحل استخراج RNA و سنتز cDNA تک رشته‌ای
ابتدا خرد‌کردن و لیز بافت‌ها و لیز سلول‌ها در یک میلی‌لیتر از محلول RNX با استفاده از دستگاه هموژنایزر در میکروتیوب‌های عاری از آنزیمRNase انجام گرفت. بعد از 5 دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق، ۱۵۰ میکرولیتر کلروفرم به هر میکروتیوب اضافه شد. پس از همگن‌سازی مخلوط و سر و ته‌کردن آن، مخلوط در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ دقیقه انکوبه شد. سپس میکروتیوب‌ها با 12000 دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفوژ شدند. با تشکیل سه فاز، RNA موجود در فاز بی‌رنگ بالایی به تیوب جدید منتقل گردید. بعد از اضافه‌کردن ایزوپروپانول به اندازه حجم مایع انتقال‌یافته، مخلوط‌کردن و انکوباسیون به مدت ۲۰ دقیقه در یخ انجام شد. نمونه‌ها در ۱۲۰۰۰ دور در دقیقه، در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفوژ شدند. سپس تخلیه فاز رویی، افزودن ۱ میلی‌لیتر اتانول ۷۵ درصد و ورتکس مخلوط تا کنده‌شدن رسوب از ته میکروتیوب انجام شد. نمونه در ۷۵۰۰ دور در دقیقه، در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۸ دقیقه سانتریفوژ شد. سپس تخلیه محلول رویی و خشک‌شدن نمونه‌ها در دمای اتاق انجام گرفت. رسوب در آب تیمارشده با DEPC حل شد و در نهایت RNA به دست آمده برای سنتز cDNA مورد استفاده قرار گرفت. برای سنتز cDNA، ابتدا انتقال 1 ماکروگرم از RNA به تیوب دیگر انتقال داده شد و یک میکرولیتر آنزیم DNAase I برای حذف DN

92