کشورهای در حال توسعه

دانلود پایان نامه

به تتراسایکلین، استرپتومایسین و سولفونامید نیز مقاومت از خود نشان می دهند و برای درمان می توان از آنتی بیوتیک های موثر نظیر کوتریموکسازول و آموکسی سیلین استفاده نمود(۱۸).
برای درمان حصبه و شبه حصبه ازآنتی بیوتیک ها استفاده می شود که از این آنتی بیوتیک ها می توان به کوتریموکسازول، کینولون ها، آزیترومایسین، آزترونام، بتالاکتام و کلرامفنیکل اشاره نمود. به علت ایجاد عوارض و مقاومت بالا به کلرامفنیکل، از سال ۱۹۷۲ میلادی به بعد دیگر از این آنتی بیوتیک در درمان حصبه استفاده نمی شود.
بیمارانی که دارای مشکلات تغذیه ای هستند باید از غذاهای پر کالری، کم حجم و سالم استفاده کنند. برای جلوگیری از تب طولانی و کم آبی ناشی از اسهال، به بیماران نوشیدن مایعات توصیه می شود اما در مواردی که این کم آبی شدید است باید بیماران مایعات را از طریق ورید دریافت کنند(۲۲).
مواردی از استفاده سالمونلا به عنوان یک آلوده کننده بیولوژیک وجود دارد به این علت که سرعت رشد و تکثیر سالمونلا بالاست و سویه هایی از سالمونلا تایفی می توانند سبب آلودگی مواد غذایی شوند.
هم اکنون برای درمان حصبه از سفالوسپورین های نسل سوم مثل سفتازیدیم و سفتریاکسون و فولورو کینولون ها مثل سیپروفلوکساسین و افلوکساسین استفاده می شود. جهت درمان سویه های مقاوم به کینولون، آزیترومایسین یا سفتریاکسون استفاده می گردد. البه شایان ذکر است در برخی از نقاط جهان درصد بالای از مقاومت سویه های سالمونلا به فلوروکینولون و سفالوسپورین های نسل سوم دیده شده است هنگامیکه این شرایط پیش می آید باید برای درمان این سویه های مقاوم از آزترونام و آزیترومایسین اسفاده نمود. هنگامی که باکتری به چند دارو مقاوم۴۴ باشد برای درمان باید از یک سفکسیم یا فلوروکینولون استفاده نمود در حالیکه برای جداسازی باکتری حساس باید از فلوروکینولون ها مثل سپیروفلوکساسین و افلو کساسین استفاده نمود(۲۳).
۱-۳ – مروری بر روش های تایپینگ باکتری ها
تیپ بندی باکتری ها به دو صورت انجام می شود که به صورت زیر می باشد:
۱) فنوتایپینگ: که بر اساس ویژگی های ظاهری باکتری ها می باشد مثل: کشت، تست های بیو شیمیایی، فاژتایپینگ و آنتی بیوگرام.
۲) ژنوتایپینگ: که از میزان دقت و حساسیت بالایی نسبت به فنوتایپینگ بر خوردار است و این تکنیک ها بر پایه ی ژنوم میکرو ارگانیسم ها شکل گرفته اند مثل: MLST45، PFGE، MLVA، Plasmid Profiling، REP-PCR46، ERIC-PCR47، PCR-RFLP، AFLP48، ۴۹AP-PCR،RAPD-PCR50 و Multiplex PCR.
البته در میان تکنیک های ژنوتایپینگ دو تکنیک MLVA و MLST از همه جدیدتر بوده است. البته شایان ذکر دو تکنیک Real Time- PCR و تکنیک LAMP51 برای تشخیص میکرو ارگانیسم ها استفاده می شود. البته در این میان LAMP دارای سرعت بالا و هزینه پایین نسبت به Real Time- PCR می باشد(۲۳).
در ابتدا برای تشخیص باکتری ها و بررسی های اپیدمیولوژیکی از تست های سرولوژی استفاده شد. البته تست های سرولوژی با مشکلاتی اعم از هزینه بالای تولید و مصرف آن، تنوع وسیع خصوصیات آنتی ژنتیکی و نیاز به استفاده از طیف وسیعی از آنتی بادی به خصوص در هنکام استفاده از این تست برای شناسایی اشرشیا کلی، به همین دلیل تکنیک های مولکولی جایگزین تست های سرولوژی شده اند.
نگرش دانشمندان و محققان با شروع عصر مولکولی با کشف ژنوم از ویژگی های ظاهری باکتری( فنوتیپ) به به خصوصیات ژنتیکی و باطنی باکتری( ژنوتیپ) تغییر یافته است. البته تکنیک های ژنوتایپینگ خود به دو دسته تقسیم می شوند که به صورت زیر می باشد:
۱) روش های ژنوتایپینگی که بر پایه ی تکثیر و همانند سازی DNA شکل گرفته اند که شامل: انواع مختلف PCR، MLVA و MLST
۲) تکنیک هایی که بر پایه ی تکثیر و همانند سازی DNA نمی باشند که شامل: PFGE و FISH52
تا کنون از تکنیک های مولکولی مختلفی جهت ژنوتایپینگ سویه مختلف سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس صورت گرفته که به تفصیل در فصل دوم و پنجم توضیح داده خواهد شد.
تمام این تکنیک هایی مولکولی دارای معایب و مزایایی نسبت به یکدیگر می باشند. MLVA یکی از روش های ژنوتایپینگ سریع و کم هزینه می باشد که مدت زمان زیادی نیست که پا به عرصه وجود کذاشته است و با توجه به مزایایی که نسبت به سایر روش های مولکولی دارد، امید می رود این تکنیک جایگزین سایرروش های ژنوتایپینگگران قیمت شود.البته شایانذکر است کهبحث مقایسه ی سایر روش های مولکولی از گنجایش این پایان نامه بدلیل گستردگی این روش ها، خارج است و سعی شده تا تکنیک MLVA را به طور کامل معرفی کرده و آنرا با سایر روش های مولکولی مقایسه کنیم و مزایا و معایب آنرا با سایر روش های مولکولی مشخص کنیم(۷).
۱-۳-۱- اصول و مبانی روش MLVA
MLVA بر پایه ی توالی های تکرار شونده۵۳ می باشد. توالی های تکرار شونده درداخل ژنوم ارگانیسم ها می باشند که دارای الگوهایی از اسید نوکلئیک( DNA یا RNA) می باشند که در چندین نسخه۵۴ در ژنوم ارگانیسم ها وجود دارند. به طور کلی این توالی ها ی تکرار شونده به دو گروه اصلی تقسیم می شوند که شامل: ۱) تکرار های پراکنده مثل SINEs و LINEs 2) تکرار های پشت سرهم که شامل میکرو ماهواره ها۵۵، ماهواره ها۵۶ و مینی ماهواره ها۵۷ می باشند. هنگامی که دو یا تعداد بیشتری از نوکلئوتید ها در کنار هم تکرار گردند، توالی تکرار های پشت سرهم شکل می گیرد به عنوان مثال توالی GTACGTACGTAC که توالی تکرار شونده ی آن GTAC است. اگر اندازه ی توالی تکرار شونده بین ۱۰ تا ۶۰ نوکلئوتید باشد، این توالی را مینی ماهواره و اگر این ان
دازه از ۶۰ نوکلئتید بزرگتر باشد آنرا ماهواره و اگر این اندازه از ۱۰ نوکلئوتید کوچکتر باشد آنرا میکرو ماهواره نام گذاری می کنند(۲۴).

شکل ۱-۴، در تصویر بالا یک نمای شماتیک از VNTR ها یا همان توالی های تکرار شونده دیده می شود که هر مربع آبی نشان دهنده یک توالی تکرار شونده می باشد. VNTR ها در هر سویه باکتریایی متفاوت می باشند.

VNTR یا تکرار های پشت سرهم با تعداد متغییر در اصطلاح به تکرار های پشت سرهمی گفته می شود که در یک ارگانیسم در مقایسه با سایر جمعیت های آن از لحاظ تعداد تکرار متفاوت می باشند. این ویژگی جالب سبب شده از زمان کشف VNTR، از این توالی های خاص در زیست شناسی، تحقیقات پزشکی جنایی۵۸، انگشت نگاری DNA59و ژنتیک استفاده می نمایند. برای اولین بار VNTR ها در ژنوم سلول های یوکاریوتی مثل انسان پیدا شد ولی این توالی ها در ژنوم سلول های پروکاریوتی مثل باکتری ها نیز وجود دارند. VNTR ها در جنس و گونه های مختلف با هم متفاوت می باشند و هر VNTR مخصوص به خود همان گونه و جنس است و با VNTR گونه یا جنس دیگر متفاوت می باشد. لیز خوردن آنزیم DNA پلیمراز در حین همانند سازی ژنوم باعث ایجاد VNTR ها می شود به همین دلیل در تعداد تکرار های VNTR تنوع وجود دارد(۲۵و۲۶).
همانطور که ذکر شد MLVA بر اساس VNTR ها شکل گرفته است. این تکنیک به تازگی برای ژنوتایپینگ باکتری ها استفاده شده است و خود را به عنوان یک تکنیک قدرتمند با حساسیت بالا در میان سایر تکنیک های مولکولی مطرح کرده است. معمولا برای انجام MLVA تعداد هفت یا بیشتر لوکوس۶۰ VNTR از ژنوم باکتری انتخاب می گردد. پس از انجام PCR و الکتروفورز، ما تعداد تکرار های هر لوکوس VNTR را بدست می آوریم. در اصطلاح به این مجموعه ی تعداد تکرار ها را الگوی اللی( پروفایل اللی) می نامند به عنوان مثال پروفایل اللی نمونه شماره یک به صورت ۱-۲-۵-۶-۳-۴-۷ و برای نمونه شماره ی دو به صورت ۳-۲-۶-۵-۴-۱-۷ می باشد البته برای آنکه معنای پروفایل اللی را بهتر متوجه شویم می توان گفت پروفایل اللی مانند یک بارکد برای هر نمونه می باشد و با ذخیره سازی این داده ها در بانک های اطلاعاتی، امکان مقایسه این داده ها با سایر داده ها و حتی پردازش مجدد این داده ها وجود دارد(۷).

شکل ۱-۵، تصویر بالا پروفایل اللی مربوط به دو سویه ی باکتریایی را نشان می دهد. مربع های رنگی توالی های مختلف VNTR را نشان می دهد.

۱-۲-۳- کلمات و اصطلاحات کاربردی در MLVA
بعد از انجام کارهای عملی مربوط به MLVA و ایجاد پروفایل اللی برای هر نمونه، نوبت به استفاده از مجموعه ای از الگوریتم های ریاضی می رسد که با استفاده از این الگوریتم ها می توان به تجزیه و تحلیل روابط فیلوژنتیکی و قرابت بین ایزوله ها پی برد. در MLVA برای بررسی ایزوله های جمعیتی از الگوریتم های MST61 استفاده می شود، البته از MST در تکنیک MLST نیز استفاده می شود. برای نخستین باردر سال ۱۹۶۰ میلادی مهندسان شهرداری برای انتخاب کوتاهترین مسیر ها برای نصب خطوط برق و مخابراتی یا انجام لوله کشی آب و فاضلاب، از این الگوریتم ها استفاده نمودند. سپس از این الگوریتم ها در زیست شناسی برای ترسیم کوتاهترین مسیر های تکاملی استفاده شد. امروزه از این الگوریتم ها برای تجزیه و تحلیل داده های تکنیک های MLST و MLVA استفاده می شود(۲۷).

شکل ۱-۶، در تصویر بالا آنالیز MLVA بوسیله MST را در یک سویه ی باکتریایی مشاهده می کنید. ایزوله هایی که در خرج ازخوشه های رنگی هستند،یکSingleton می باشند و هر خوشه رنگی نشان دهنده یک کلونال کمپلکس۶۲ می باشد.

اگر دو ایزوله در یک لوکوس VNTR در پروفایل اللی خود با هم تفاوت داشته باشند، در اصطلاح نسبت به هم، SLV63 می باشند به عنوان مثال ایزوله ی شماره یک با پروفایل اللی ۳-۲-۱-۷-۲-۴-۳ نسبت به ایزوله ی شماره دو با پروفایل اللی ۳-۲-۱-۷-۲-۴-۲، SLV می باشد. حال اگر دو ایزوله در دولوکوسVNTRدرپروفایل اللی خودباهم تفاوت داشته باشند، در اصطلاح نسبت به یکدیگر، DLV64هستند. هرعدد غیر مشابه ای نشان دهنده ی یک الل جدید می باشد و تنها در اینجا تفاوت در جایگاه های لوکوسی دارای اهمیت می باشد. بنیان گذار زیر گروه۶۵ در اصطلاح به ایزوله ای گفته می شود که حداقل دو SLV از آن منشاء گرفته است. کلونال کمپلکس یا دودمان۶۶ در اصطلاح به یک ایزوله ی مرکزی همراه با SLV و DLV های مربوط به آن گفته می شود. اعضای مربوط به یک کلونال کمپلکس قرابت ژنتیکی نزدیکی به هم دارند و احتمالا از یکدیگر مشتق شده اند. Singleton در اصطلاح به ایزوله هایی گفته می شود که در هیچ کلونال کمپلکسی قرار ندارند یا به عبارتی دارای بیش از دو تفاوت در جایگاه های لوکوسی در پروفایل اللی خود هستند. جمعیت های باکتریایی از تعدادی singleton و کلونال کمپلکس تشکیل شده اند. البته شایان ذکر است که MST نشان دهنده زمان تکامل نمی باشد و تنها ارتباط تکاملی ایزوله ها را نشان می دهد(۲۷).
۱-۳-۳- مزایای MLVA نسبت به سایر روش های ژنوتایپنگ
هر تکنیک ژنوتایپینگ دارای مزایا و معایبی می باشد. مزایای بیشمار تکنیک MLVA سبب شده که این تکنیک جای خود را در میان سایر تکنیک های ژنوتایپینگ باز کند و بیشتر مورداستفاده ی میکروبیولوژیستهاو اپید میولوژیستها قرارگیرد. بهطور خلاصه مزایای تکنیکMLVA رادر شکل ۱-۷ مشاهده می نمایید.

شکل ۱-۷، در تصویر بالا تعدادی از مزایای MLVA را به طور خلاصه مشاهده می کنید.

مزایای تکنیک MLVA عبارت است از:
۱) هزینه۶۷: مشکلاتی که همواره پیش روی طرح های تحقیقاتی میباشد، هزینه ی
انجام این طرح ها است و این هزینه ها در کشورهای در حال توسعه دارای اهمیت می باشد. MLVA یک تکنیک مبتنی بر PCR است و دارای هزینه های به مراتب کمتر نسبت به سایر تکنیک ها از جمله PFGE و MLST می باشد. در تکنیک PFGE نیاز به دستگاه ها و مواد گرانقیمت می باشد و در MLST ممکن است به علت تعیین توالی ۶۸ محصولات PCR هزینه ها به اندازه ی تکنیک PFGE یا بیشتر از PFGE شود(۷).
۲) راحتی و سادگی انجام آن۶۹: مزیت تکنیک MLVA اینست که نیاز به تبحر و تخصص خاصی ندارد. موفقیت MLVA نسبت به سایر تکنیک های مبتنی بر PCR آنست که این تکنیک ساده می باشد و آنالیز داده های آن نیز سریع است(۷, ۲۴) (شکل ۱-۸).

شکل ۱-۸، آنچه سبب موفقیت این تکنیک نسبت به سایر روش های تایپینگ شده است، سریع بودن و سادگی آن است. مراحلی که در MLVA انجام می شود شامل: ۱) کشت دادن باکتری ۲) استخراج ژنوم باکتری ۳) انجام دادن واکنش PCR برای لوکوس های VNTR 4) الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آکاروز ۵) عکس گرفتن از ژل پس از انجام الکتروفورز ۶) تبدیل کردن اندازه ی باند ها به تعداد تکرار و آنالیز داده ها که در مرحله ی آخر صورت می گیرد.

۳) در دسترس بودن۷۰: به وجود داشتن تجهیزات، مواد مصرفی و نوع مهارت به تکنیک مورد نظر وابسته است. تکنیک هایی که بر پایه ی PCR هستند مانند MLVA، تنها نیاز به یک دستگاه ترموسایکلر دارند ولی در تکنیک هایی مثل PFGE نیاز به مواد و دستگاه هایی است که دارای قیمت بسیار بالایی هستند. در ضمن تکنیک هایی که بر پایه ی PCR می باشند را می تواند در یک آزمایشگاه معمولی انجام پذیرد و نیاز به افرادی که دارای تخصص و تبحر هستند، نیست(۷, ۲۴).
۴) سرعت انجام آن۷۱: زمان مورد نیاز جهت انجام و آماده سازی یک تکنیک را اصطلاحا سرعت آن تکنیک می گویند. تکنیک PFGE یک تکنیک زمانبر می باشد و زمان مورد نیاز برای انجام حداقل سه روز کاری می باشد ولی به دلیل آنکه MLVA یک روشی است که بر پایه ی PCR صورت می پذیرد به همین دلیل در کمترین زمان ممکن( چند ساعت) قابل انجام است. سرعت تکنیک هایی نظیر ERIC-PCR، REP-PCR، RAPD-PCR، MLST و MLVA به دلیل مبتنی بودن بر PCR نسبت تکنیک هایی مثل: ریبوتایپینگ۷۲ و PFGE بسیار بالاتر است(۷, ۲۴).
۵) تکرارپذیری۷۳: توانایی یک تکنیک ژنوتایپینگ در تولید نتیجه های کاملا یکسان و شبیه را بر روی یک نمونه ی مشخص در مکان ها و زمان

این نوشته در پایان نامه ها و مقالات ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *