ژانویه 5

جمع آوری اطلاعات

ژنوتایپینگ و شناسایی سروتایپ های سالمونلا استفاده نمودند. جهت انجام PFGE از آنزیم برش دهنده ی Xbal استفاده نمودند(۴۵).

مواد وروشها

بخش اول
۳-۱-مواد و تجهیزات
۳-۱-۱-دستگاه ها ووسایل مورد نیاز:
– هود میکروبیولوژی کلاس ۲ – لوپ کالیبره یک هزارم میلی لیتر
– هود شیمیایی آزمایشگاهی – ارلن در اندازه های مختلف
– انکوباتور شیکردار – مزور در اندازه های مختلف
– بن ماری دیجیتال دقیق قابل تنظیم – بالن ژوژه در اندازه های مختلف
– ترازوی دیجیتال با حساسیت حد اقل ۰/۰۰۰۱ گرم – چراغ بونزن
– میکروسانتریفوژ یخچال دار شرکت سیگما۹۷ – پیپت پاستور
– اسپکتروفوتومتر با قدرت قرائت نمونه در طول – لام و لامل
موجهای مختلف شرکت بیورد۹۸ آمریکا – جا لوله ای
– شیکر معمولی آزمایشگاه – فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد
– انکوباتور معمولی آزمایشگاه
– فور – هیتر
– دستگاه ورتکس
– سمپلر های متغییر (۱۰-۰/۵ ،۱۰۰-۱۰ ،۱۰۰-۱۰۰ میکرولیتری)
– میکروسکوپ نوری شرکت نیکون۹۹ ژاپن
– دستگاهPCR مدل Vapo-Protect شرکت اپندورف۱۰۰ آلمان
– دستگاه اتو کلاو شرکت بیندر۱۰۱
– یخچال معمولی آزمایشگاه
– سیستم الکترو فورز شامل منبع تغذیه ولتاژ و تانک های مختلف بایورد آمریکا
– دستگاه تصویر برداری از ژل مجهز به سیستم
عکس برداری،همچنین تهیه پرینت از تصویر و ذخیره اطلاعات، بایورد آمریکا
– ظروف رنگ آمیزی ژل – لوله های شیشه ای سر پیچدار استریل
– آنس یا فیلدوپلاتین نوک تیز
۳-۱-۲-مواد مصرفی مورد نیاز:
– میکروتیوب های استریل در اندازه های مختلف(۰/۵ و ۲ سی سی)
– پرایمرهای PCR
-آنتی سرم های پلی والان و مونووالان شرکت Mast assure
– لوله های شیشه ای سر پیچدار استریل
آزمایشگاهی در اندازه های مختلف – پارا فیلم
– سر سمپلر در اندازه های مختلف (۱۰-۰/۵ ، ۱۰۰-۱۰ ،۱۰۰۰-۱۰۰ میکرولیتری) – آب مقطر استریل و دیونیزه
-کیت مسترمیکسAmpliqon®
– SDS – پروتئیناز K (20mg/mI )
– NaCI – Tris base و Tris-HCL(1 مولار)
– EDTA – فنول اشباع و کالیبره شده
– کلروفرم – ایزوآمیلیک الکل
– اتانول خالص – RNase (mg/mI20)
– آگاروز (شرکتGibco BRL) – بوریک اسید
– بافر لود کننده DNA(6X) – اتیدیوم بر ماید
– سواب پنبه دار استریل – برچسب
– پنبه – دستکش یکبار مصرف
– پارافین مایع استریل – پلیت یکبار مصرف
– خط کش – آب مقطر دوبار تقطیر شده و دیونیزه
۳-۱-۳- محیطهای کشت مورد استفاده:
– TSB broth -Urea Agar Base
– LB broth – Lysine Iron Agar
– BHI broth – SIM Medium Agar
– XLD Agar – Muller Hinton Agar
– Hekton enteric Agar – Ornithin Base Medium
– Mac Conkey Agar – Carry Blair Transport Medium
– Triple Sugar Iron(TSI) Agar – Skim Milk
– Simmon Citrate Agar – LB Broth
– MRVP Medium Agar -Triptose Agar

بخش دوم

۳-۲-ترکیبات و محلولهای مورد نیاز و فرمول ساخت آنها

۳-۲-۱-تهیه محلول(%۲۵) SDS:
– SDS 25 گرم
– آب مقطر ۱۰۰

– ۳-۲-۲- محلول EDTA(5/0 مولار):
– EDTA 6/18 گرم
-آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر
*تذکر :جهت حل نمودن باید حرارت داده شود و PH آن با سود به میزان ۸ برسد
۳-۲-۳-تامپون لیز کننده سلول:
– NacI (1 مولار) ۲۵ میلی لیتر
– Tris_HCL (1 مولار) ۵/۱۲میلی لیتر
– EDTA(0/5 مولار) ۲۵ میلی لیتر
– آب مقطر تا حجم کلی ۲۵۰ میلی لیتر
۳-۲-۴- تامپون TE حاوی RNase
– EDTA (0/5مولار) ۵/۰ ملی لیتر
– Tris_HCL (1 مولار) ۵/۲ میلی لیتر
– RNase ) 20mg/mI ( ۲۵/۰میلی لیتر
– آب مقطر تا حجم کلی ۲۵۰ میلی لیتر
۳-۲-۵- بافر(۵X)TBE:
– Tris-base ۵۴ گرم
– Boric Acid ۵/۲۷ گرم
-EDTA(5/0 مولار ۸=PH ) ۲۰ میلی لیتر
– آب مقطر تا حجم کلی ۱ لیتر
۳-۲-۷- محلول فنل-کلروفروم-ایزو آمیلیک الکل(PCI):

– فنل اشباع کالیبره شده ۲۵ میلی لیتر
– کلروفرم ۲۴ میلی لیتر
– ایزوآمیلک الکل ۱ میلی لیتر
حجم کل ۵۰ میلی لیتر

بخش سوم

۳-۳- روش انجام طرح:

۳-۳-۱- نوع مطالعه:
مطالعه از نوع توصیفی-مقطعی بوده است.

۳-۳-۲-جامعه مورد مطالعه:
باکتریهای مورد استفاده در این تحقیق مربوط به سال های ۱۳۸۷ تا ۱۳۸۹ می باشند.این نمونه های بالینی از بیماران مشکوک به عفونت با سالمونلا که به بیمارستان های شهر تهران از جمله بیمارستان بقیه الله (عج) ، مرکز طبی کودکان و برخی از آزمایشگاه های سطح شهر مراجعه کرده بودند،اخذ و مورد بررسی و مطالعه قرار گرفتند.

۳-۳-۳- جمع آوری اطلاعات:
در زمان پذیرش بیماران ،پرسشنامه ای مشتمل بر سوالات مربوط به زمان شروع علائم،جنس،آدرس محل سکونت بیمار و سایر اطلاعات تکمیل می گردید. هر بیمار با کد مخصوص مشخص گردیده و شماره پرونده آن ثبت می گردید، که با هماهنگی های به عمل آمده با مسئولین آزمایشگاه های میکروب شناسی مراکز یاد شده این اطلاعات اخذ می شد.

۳-۳-۴- انجام امور باکتریولوژیک:
الف) کشت، جداسازی و تعیین هویت ایزوله های سالمونلا
طبق روش استاندارد،نمونه های بالینی از جمله مدفوع، خون و غیره از بیماران مشکوک به عفونت با سالمونلا گرفته می شدند.
نمونه مدفوع بیماران بلافاصله پس از نمونه گیری به محیط کشت سلنیت F منتقل می گردید. نمونه ها به مدت حد اکثر ۶ ساعت در این محیط نگهداری می شدند.سپس به محیط های کشت انتخابی، مانند Salmonella-Shigella(SS) agar، بیسموت سولفیت آگار sulfite agar Bismuth و سایر محیط های کشت، انتقال یافته و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار داده شدند.
نمونه های خون نیز ابتدا در biphasic(solid and liquid) medium کشت داده شده و سپس به محیط های انتخابی انتقال داده می شدند. در روز بعد کلونی های مشکوک به سالمونلا جدا سازی می شدند و سپس توسط تست های بیو شیمیایی استاندارد نظیر انتقال بر روی محیط ،Simmon citrate agar Triple sugar iron(TSI) ،اوره و MRVP brothمورد شناسایی قرار می گرفتند.
پس از انجام آزمون های بیوشیمیایی، جهت جداسازی و تایید سالمونلا، آزمون سرو تایپینگ جهت مشخص نمودن آنتی ژن های O وH با آنتی سرم اختصاصی مربوطه انجام گردید(Staten
Institut.Copenhagen. Denmark) Serumبدین ترتیب که پس از تهیه سو سپانسیون باکتری و مجاور کردن آن با آنتی سرم، در صورت مثبت بودن به مدت ۱ تا ۲ دقیقه آگلوتیناسیون بر روی اسلاید مشاهده گردید.
ب)استخراج ژنوم باکتریایی
پس از جداسازی و تعیین هویت ایزوله های باکتریایی، با استفاده از روش جوشاندن۱۰۲، ژنوم باکتریایی استخراج گردید. ابتدا باکتری ها در محیط BHI براث( ۱۰ میلی لیتر) به مدت یک شبانه روز کشت داده شدند. سپس کدورت لوله های واجد کشت مایع با استفاده از اسپکتوفوتومتر در طول موج ۶۰۰ نانومتر خوانده شد. اگر OD برابر با چهار یا بیشتر باشد، تعداد باکتری های موجود در لوله برای استخراج مناسب خواهد بود.
سپس محیط های کشت به میکروتیوب های دو میلی لیتری انتقال یافت و به مدت ده دقیقه در دور ۹۰۰۰ دور سانتریفوژ گردید تا رسوب باکتری بدست آید. پس از حذف مایع رویی، ۴۰۰ میکرولیتر آب مقطر دیونیزه به رسوب باکتریایی اضافه گردید سپس سوسپانسیون حاصل، ۱۵ دقیقه در دمای ۱۰۰ درجه سانتی گراد جوشانده شد. میکروتیوب دوباره به مدت ۱۰ دقیقه در دور ۶۰۰۰ دور، سانتریفوژ شدند و ۱۰۰ میکرولیتر از مایع رویی( به عنوان ژنوم استخراج شده) با استفاده از سمپلر جمع و در یک میکروتیوب جدید جمع آوری گردید.
ج) اندازه گیری مقدار DNA استخراج شده
این عمل به کمک دستگاه اسپکتوفوتومتر( نانودراب) در طول موج های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر به ترتیب برای بررسی میزان جذب DNA و پروتئین ها وتعیین میزان خلوص DNA انجام می گردید. این عمل به اینصورت انجام می شود که ابتدا بوسیله دو میکرولیتر آب مقطر دیونیزه دستگاه را بلانک کرده و سپس از نمونه خود دو میکرولیتر برداشته و OD 260 به ۲۸۰ نانومتر را می سنجیم.

بخش چهارم: آزمایش های مولکولی

۳-۴- ژنوتایپینگ ایزوله های سالمونلا با استفاده از روش MLVA
۳-۴-۱- انجام آزمایش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR
برای تیپ بندی ژنتیکی ایزوله های سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس با استفاده از تکنیک MLVA، از ۸ لوکوس VNTR مختلف استفاده شد. پرایمر های که برای انجام PCR استفاده شد، از سه مقاله مختلف انتخاب گردید(۳۶, ۴۰, ۴۳).
ویژگی این پرایمر ها آن بود که به تعیین توالی۱۰۳ نیازی نداشت.این لوکوس های VNTR، هم از نظر اندازه و هم از نظر تعداد تکرار مناسب بودند. به عبارت دیگر، اندازه ی تکرار آن ها به قدری بود که با استفاده الکتروفورز بر روی ژل آگارز، کاملا از یکدیگر تفکیک می شدند. نام لوکوس ها و پرایمر های انتخابی در جدول ۳-۱ نمایش داده شده است. این پرایمر ها پس از انجام بلاست۱۰۴، از شرکت ماکروژن۱۰۵ کره جنوبی سفارش داده شدند.

جدول ۳-۱، نام لوکوس ها و پرایمر های اختصاصی

لوکوس VNTR
پرایمر
توالی
اندازه پرایمر(bp)

SE-10
Forward
۵’-GCTGAGATCGCCAAGCAGATCGTCG-3’

۵۰

Reverse
۵’-ACTGGCGCAACAGCAGCAGCAACAG-3’

SENTR2
Forward
۵’-CACTGGACGATCTGGATTTCTC-3’

۴۱

Reverse
۵’-GTCGCCGTTACGCATCAAC-3’

SENTR3
Forward
۵’-CTAAACAAGCCGCTCATCCG-3’

۳۹

Reverse
۵’-ACAACCTGCTGCTGTGCTG-3’

SE-7
Forward
۵’-GATAATGCTGCCGGTAA-3’

۴۱

Reverse
۵’-ACTGCGTTTGGTTTCTTTTCT-3’

SE-4
Forward
۵’-ACTTTAGAAAATGCGTTGAC-3’

۴۰

Reverse
۵’-AAGTCAACTGCTCTACCAAC-3’

SE-6
Forward
۵’-CCCCTAAGCCCGATAATG-3’

۳۳

Reverse
۵’-GCCGTTGCTGAAGGT-3’

SE-8
Forward
۵’-TTGCCGCATAGCAGCAGAAGT-3’

۴۶

Reverse
۵’-GCCTGAACACGCTTTTTAATAGGCT-3’

ENTR6
Forward
۵’-TGTGGGGTAAGGATACGGGG-3’

۴۳

Reverse
۵’-GGCAAAGGGAGCAGACTGTAAAT-3’

واکنش PCR برای هر لوکوس VNTR در حجم نهایی ۲۰ میکرولیتر در دستگاه ترموسایکلر اپندروف انجام گرفت.مقادیر و ترکیبات اولیه مورد استفاده برای هر واکنش در جدول ۳-۲ ارائه شده است.

جدول ۳-۲، مقادیر مورد نیاز جهت انجام واکنش های PCR برای تکثیر لوکوس های VNTR
اجزای واکنش
غلظت
حجم( میکرولیتر)
DNA Template

۲
مستر میکس شرکت Ampliqon® واجد آنزیم Taq DNA polymerase به همراه dNTP و MgCl₂ ۱.۵ میلی مولار

۱X

۱۰
Primer Forward
۲۰pmol
۱
Primer Reverse

۱
آب مقطر دیونیزه

۵
حجم

۲۰

برای رقیق سازی پرایمر ها طبق فرمول زیر عمل می کنیم:

N₁V₁= N₂V₂
۱۰۰(pm)x
X=20(pm) x 100µL → x=20µL
حال این مقدار از پرایمر را با آب مقطر دو بار تقطیر به حجم ۱۰۰ میکرولیتر می رسانیم.

برنامه ریزی دستگاه PCR برای تمامی لوکوس های VNTR به صورت زیر بود:
۱) واسرشت اولیه: در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت سه دقیقه
۲) واسرشت: در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ ثانیه
۳) اتصال: به مدت سی ثانیه و دمای آن برای هر پرایمر متفاوت بود
۴) گسترش: در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۴۰ ثانیه
۵) گسترش نهایی: در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۷ دقیقه
۶) تعداد دور ها: ۳۴ چرخه

جدول ۳-۳، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس های SENTR2، SENTR3 و SE-7
واسرشت اولیه
۳۴ سیکل

گسترش نهایی

واسرشت

اتصال

گسترش

در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت سه دقیقه
در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت سی ثانیه
در دمای ۵۷ درجه سانتی گراد به مدت سی ثانیه
در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت چهل ثانیه
در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۷ دقیقه

جدول ۳-۴، برنامه ریزی دستگاه ترمو سایکلر جهت تکثیر لوکوس های ENTR6 و SE-8
واسرشت اولیه
۳۴ سیکل
گسترش نهایی

واسرشت
اتصال
گسترش

در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت ۳ دقیقه
در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت سی ثانیه
در دمای ۶۶ درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ ثانیه
در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۴۰ ثانیه
در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت ۷ دقیقه

جدول ۳-۵، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر لوکوس SE-4
واسرشت اولیه

۳۴ سیکل
گسترش نهایی

واسرشت
اتصال
گسترش

در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت سه دقیقه
در دمای ۹۴ درجه سانتی گراد به مدت سی ثانیه
در دمای ۵۸ درجه سانتی گراد به مدت سی ثانیه
در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد به مدت



همه حقوق محفوظ است

Posted ژانویه 5, 2019 by mitra4--javid in category "پایان نامه ها و مقالات

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *